本发明涉及基因突变检测领域，更具体地涉及一种基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术及其应用。
背景技术：
1、基因突变是疾病发生和发展的关键因素，因此准确、及时的突变检测对于疾病的诊断、风险评估、预后判断以及用药指导至关重要。目前，基因突变检测方法多种多样，包括杂交化学法(如fish和cish)，二代测序(ngs)，定量聚合酶链式反应(qpcr)，数字pcr等。杂交化学法则主要用于检测染色体结构变异。ngs测序方法成本较高、适用于高通量、全面的基因组测序；基于ngs的多重核酸抑制探针置换扩增放大技术可在250×测序深度可实现80重的高通量以及0.019％的检测限(nat biomed eng,2021,5,690–701.)。
2、qpcr常用于基因的定性定量检测，在dna突变检测上灵敏度和通量有限；特异性等位基因pcr可提高qpcr的灵敏度，但适用于检测特定变异，区分两种已知的核苷酸变异。多重pcr技术凭借其独特的优势，在多个领域展现出了广泛的应用前景。它采用单一试剂体系，既经济又高效，能够实现对多个基因的同步扩增检测，显著减少了检测所需的试剂和样本量。这使得多重pcr在遗传病筛查、病原体检测、耐药基因分析以及癌症早期诊断等多个领域得到了广泛应用(cn116219071b、cn116516075b、cn115896312a、cn115896312a、cn112592964a、cn100372945c、cn1936019b；cn108823287b、cn114622000a、cn112592964a、cn115109840a；nat biomed eng.2017,1,714–723 2017.)。
3、然而，尽管多重pcr具有诸多优点，但受限于仪器荧光通道的数量，基于荧光探针的多重pcr技术在实际应用中仍需要采用分管检测的方式，这在一定程度上限制了其通量和效率。现有技术还通过结合多色组合、探针编码以及多色熔解曲线分析等方法，使单管多重pcr检测的靶标数量得到了显著提升，成功突破了10重的限制(plos one,2011，6，e16033，ep2436777b1，us 9334533 b2)。
4、例如，一种基于qpcr和taqman探针的多重核酸抑制探针置换扩增技术，针对野生型模板设计抑制探针，利用其与野生型模板完全杂交而在pcr过程中抑制野生型扩增，而突变型模板与抑制探针不完全匹配从而在pcr过程中实现突变的扩增和富集。该方法使用核酸抑制探针置换扩增技术富集低频dna突变，利用taqman探针对突变进行定性和定量。通过混合和检测靶标所需的引物和探针，该方法单管反应可检测3个靶标，3个通道实现9重检测(nat biomed eng,2017,1,714–723 2017.)。虽然该方法使用基于taqman的qpcr检测技术，结合多重核酸抑制探针置换扩增技术可放大检测0.1％突变，但多重检测需要分管。
5、一种“meltarray”多重qpcr技术，使用多重扩增探针熔解曲线法结合中介探针。该技术使用12个不同的中介引物与分子信标报告基因环上不同的预定义区域互补，利用分子信标与多个媒介引物形成一系列具有不同熔点的荧光双链，实现在单个荧光通道检测12个靶标。该技术提高了qpcr的检测通量，每个反应可检测到30个靶标分子(pnas,2022,119,e2110672119，参见中国专利cn108823287b)，但该技术最低只能检测到5％的突变，灵敏度有待优化。
6、一种meteor-dpcr技术，使用靶标与半标记和右半标记并添加用于识别靶标的条形码序列，用荧光疏松分子信标探针与条形码序列结合形成具有不同溶解温度的dna链，实现多路复用的定量基因组合分析。一次检测该方法可以同时定量60个靶标，使用3个荧光通道预计可达到216重(advsci，2023,10,2301630.)。该技术同已有meltarray技术一样可检测几十到上百重，但单重检测通量只检测1个突变。
7、目前的多重pcr检测技术主要基于荧光染料和荧光探针的方法。基于荧光染料的技术利用荧光颜色和熔解曲线特性，通过不同的熔解温度来识别不同的扩增片段的靶标，进而实现多重检测。而基于荧光探针的多重pcr技术由于仪器荧光通道有限，单管检测靶标数受到限制，而增加靶标数量需要进行繁琐的“分管设计”，限制了通量并增加了成本和时间。通过结合不同的荧光通道、荧光种类及浓度、熔解温度等，可提高多重qpcr的通量。虽然这些技术在多靶标检测方面具有优势，但其灵敏度有待提高，同时，设计和优化过程繁琐且成本高，限制了其在实际应用中的推广。
8、由此可见，现有的多重pcr检测技术面临着多重挑战，包括设计复杂性高、成本昂贵、灵敏度受限以及单次反应通量难以提升等问题。这些问题限制了多重pcr技术在实验室研究和临床中的广泛应用。尽管目前的单管多重pcr检测技术已经能够实现单管检测高通量基因突变，但在检测灵敏度方面仍存在一定的局限性，需要进一步提升。另一方面，那些具备高灵敏度的pcr检测技术，在单管检测时却往往难以达到理想的通量水平。因此，有必要开发一种更简便、低成本、高灵敏的单管多重pcr技术，以满足基因突变检测等领域对更高通量、低成本检测方法的需求。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术及其应用，从而解决现有技术缺乏一种更简便、低成本、高灵敏的单管多重pcr技术，以满足基因突变检测等领域对更高通量、低成本检测方法的需求的问题。
2、为了解决上述问题，本发明采用以下技术方案：
3、根据本发明的第一方面，提供一种基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术，包括以下步骤：s1：使用多重qpcr扩增所有的dna靶标，采用特异性反向引物测序获取所有靶标测序结果，构建参考序列库；s2：使用多重qpcr扩增所有的dna靶标，采用通用引物测序获取qpcr产物混合图谱；s3：使用ai图谱解析技术解析步骤s2中获取的混合图谱，将所述混合图谱与步骤s1中构建的所述参考序列库中序列对比，确定含有突变被放大的序列，从而实现dna及低频突变的多重检测。
4、优选地，步骤s1、s2包括：针对野生型dna模板设计多重核酸抑制探针，通过基于qpcr的核酸抑制探针置换扩增技术，使得野生型dna模板被抑制而突变型dna模板正常扩增，采用特异性反向引物测序获取突变型的单一序列，采用通用引物测序获取突变型的混合序列，根据qpcr扩增ct值的变化实现突变的初筛。
5、优选地，步骤s3中，所述ai图谱解析技术采用动态时间规整算法及点对点比对算法来计算相似性。
6、优选地，所述动态时间规整算法包括：dtw单谱随机组合比对算法、dtw单谱逐步比对叠加算法。
7、根据本发明的一个优选方案，dtw单谱随机组合比对算法的解析流程如下：
8、1)获取所有dna扩增序列及长度信息；
9、2)根据a、g、c、t四个通道，从fp端开始，5’到3’方向提取特异性引物测序单谱及up测序混谱的1100个坐标数据；读取混谱时，以找到的最长序列作为参考，提取1100个坐标数据，而其他序列补0至最混谱中最长序列长度；
10、3)除以各个序列的纵坐标最大值并乘以100来标准化各个序列，以减小混谱纵坐标数据与各个单谱纵坐标数据存在差异；
11、4)将单谱序列坐标数据进行任意组合，其公式为其中n为共混入的单谱序列个数，k为任意组合的个数；
12、5)任意组合的单谱坐标数据是相加起来的，需再一次除以组合的单谱坐标数据的最大值并乘以100来标准化组合序列坐标数据；
13、6)根据a、g、c、t四个通道，利用dtw算法对比组合序列及混谱纵坐标数据，其公式如下：
14、dist(x,y)＝|x-y|
15、d(i,j)＝dist(i,j)+min[d(i-1,j),d(i,j-1),d(i-1,j-1)]
16、其中，x,i为混谱纵坐标数据，y,j为组合序列的纵坐标数据。若d(i,j)越小，代表该组合序列及混谱的相似度越高；
17、7)将获取的4通道的组合序列及混谱序列的dtw距离相加除以4，计算出组合序列与混谱序列的(平均)最短dtw距离，得出最相似的单谱组合序列，并根据有(平均)最短dtw距离的组合单谱序列，预测混谱中包含的序列。
18、根据本发明的一个优选方案，所述dtw单谱逐步比对叠加算法的解析流程如下：
19、1)获取所有dna扩增序列及长度信息；
20、2)根据a、g、c、t四个通道，从fp端开始，5’到3’方向提取特异性引物测序单谱及up测序混谱的1100个坐标数据；读取混谱时，以找到的最长序列作为参考，提取1100个坐标数据，而其他序列补0至最混谱中最长序列长度；
21、3)除以各个序列的纵坐标最大值并乘以100来标准化各个序列，以减小混谱纵坐标数据与各个单谱纵坐标数据存在差异；
22、4)通过肉眼识别混合图谱中的最长序列，比较混合图谱与最长序列中的峰的横坐标数据，计算出混合图谱的拉伸比例，将混合图谱的横坐标乘以该拉伸比例，以减少横坐标数据的偏移；
23、5)利用序列位置信息从最长序列开始判断该单谱序列是否存在混谱中，直至最短的单谱序列。
24、6)根据a、g、c、t四个通道，利用dtw算法逐步对比相应位置的单谱序列及混谱纵坐标数据，dtw比对的位置为该单谱序列至下个单谱序列长度，最低需截取100个数据点，通过计算各通道的最低dtw距离找到单谱各通道的最低权重，权重的范围为0到2，间距为0.1；若混谱比对算出的其中三个通道的最低dtw距离并非该位置的单谱或该位置的单谱其中两个通道≤0.1，则判定该单谱不存在混谱中，权重为0，若判定存在，该序列根据各通道乘于权重加入组合序列中，其公式如下：
25、dist(x,y)＝|x-y|
26、d(i,j)＝dist(i,j)+min[d(i-1,j),d(i,j-1),d(i-1,j-1)]
27、ifd(i,j)＝min[d(i,j)],n＝best_n
28、form＝1∶k
29、combined_sequence[m]＝combined_sequence[m-1]+n*sequence[m]
30、其中，x,i为混谱纵坐标数据，y,j为组合序列的纵坐标数据。若d(i,j)越小，代表该组合序列及混谱的相似度越高，n为使dtw距离最短的最优权重，k为序列总数，m为序列号(1-k)；
31、7)根据被判定混入混谱中的单谱，预测混谱中的突变序列。
32、根据本发明的一个优选方案，所述点对点比对算法的解析流程如下：
33、1)获取所有dna扩增序列及长度信息；
34、2)根据a、g、c、t四个通道，从fp端开始，5’到3’方向提取特异性引物测序单谱及up测序混谱的1100个坐标数据；读取混谱时，以找到的最长序列作为参考，提取1100个坐标数据，而其他序列补0至最混谱中最长序列长度；
35、3)除以各个序列的纵坐标最大值并乘以100来标准化各个序列，以减小混谱纵坐标数据与各个单谱纵坐标数据存在差异；
36、4)根据a、g、c、t四个通道，利用点对点相似比对算法计算各个fp序列数据在up序列数据内的相似度，越靠近1代表越相似。其算法的公式为其中f(x)为该单谱序列与混谱序列的点对点相似度，i为a、g、c、t四个通道，j为通道的各纵坐标数据；
37、5)根据5重的数据判定，f(x)小于6代表该单谱序列在混谱序列中存在突变，通过计算得出所有小于6的单谱序列，预测混谱中包含的序列。
38、根据本发明的一个优选方案，步骤s3中，所述ai图谱解析技术还包括构建一个混谱解析模型，使该模型能够自主学习并有效地识别混合图谱中的突变序列，其中，机器学习的解析流程如下：
39、1)数据收集：收集所有样本数据，并对其进行预处理，包括特征提取、选择和标准化；
40、2)数据划分：将数据集按7：3比例划分为训练集和测试集，训练集包含所有的单谱，大量组合谱及少量的测序混谱，而测试集包含少量组合谱及大量的测序混谱；
41、3)训练模型：使用参考序列库的单一谱、大量组合谱以及少量测序混谱作为训练集，建立输入x(谱图)和输出y(存在的单谱序列)变量之间的数学(映射)关系。这样的x、y对构成了用于建立模型的标签数据，以便学习如何从输入中预测输出，接着对其进行参数调优及特征选择，训练出一个完整的模型；
42、4)模型评估与优化：持续对模型进行效果评估和优化，包括数据集分割、超参数调优和模型更换等手段，使用性能度量指标进行量化评估。
43、5)测试模型：将剩余的组合谱和测序混谱作为测试集，输入到最终的测试模型中，进行预测并评估模型的性能指标。
44、采用长片段核酸抑制探针使富集区间最长可达44nt，实现突变的高通量放大检测。
45、根据本发明的一个优选方案，qpcr扩增条件包括：
46、qpcr循环步骤可以按照变性-退火-延伸的步骤进行，也可以按照变性-退火+延伸的方式扩增；
47、qpcr的退火温度范围在50℃～72℃之间，退火温度也可随着循环数的增加而改变；
48、qpcr中使用的退火延伸时间包括但不限于30s～5min；
49、qpcr扩增的循环数通常但不限30～60个循环；
50、qpcr中可以使用的dna聚合酶包括高保真聚合酶和低保真聚合酶。高保真聚合酶包括但不限于q5、phusion、kapa等，低保真聚合酶包括但不限于taq、powerup、itaq、hieffunicon等；
51、qpcr的引物浓度范围在1nm～10μm之间；
52、qpcr的核酸抑制探针浓度范围在1nm～100μm之间；
53、qpcr的各种物质浓度，包括但不限于mg2+浓度在1mm～100mm之间，dntp浓度在20μm～20mm之间，dmso浓度在1％～30％之间，na+浓度在100mm～10m之间。
54、根据本发明的一个优选方案，pcr引物设计可以使用但并不限于ncbi primerdesigning tool、primer premier 5。
55、根据本发明的一个优选方案，通过使用优化过的关键参数，可持续改进检测性能，包括优选合适的dna聚合酶、预混液体系以及退火延伸时间，有助于加大qpcr每轮扩增对突变模板的富集能力，增加野生型和突变型信号差别。
56、根据本发明中所使用的基于qpcr的核酸抑制探针置换扩增突变放大技术，该技术的核心思路是根据已知的野生型dna序列，设计出一系列的核酸抑制探针(b)，利用抑制探针可以和野生型模板完美杂交，从而抑制其在pcr过程中的扩增。突变型模板由于突变碱基的存在造成与抑制探针错配从而不稳定，因此抑制探针可以被正向引物取代，使得突变型模板扩增效率大于野生型模板。经过pcr多轮扩增，最终达到抑制野生型并放大突变型的目的。为实现核酸抑制探针置换扩增技术对野生型模板的抑制和突变型模板的富集，野生型模板反应的δδg°rxn会设计为正值(约+2kcal/mol)，而突变型模板反应的δδg°rxn会设计为负值(约-2kcal/mol)。设计的核酸抑制探针3’端需要添加封闭基团以抑制dna延伸，封闭基团包括但不限于磷酸化修饰、间臂、肽核酸(pna)、锁定核酸(lna)以及dxxdm，d是dna残基，x是c3间臂，m是错配(图2)。核酸抑制探针长度通常为19～36nt，gc含量在40％～60％之间，最大均聚物长度不超过4；引物与模板的结合自由能变化δg范围为-14kcal/mol～-17kcal/mol。核酸抑制探针与fp有一定的重叠区间，长度一般为7～12nt。
57、根据本发明的一个优选方案，通用引物不能与panel中引物、抑制探针杂交形成二聚体，不影响靶标序列的扩增，包括但不仅限于本发明中使用的序列。
58、根据本发明的一个优选方案，本发明中的设计多重引物及抑制探针，使用核酸序列分析平台nupack(但不限)分析，预测核酸的二级结构、热力学参数、杂交和配对，均聚物一般不超过4，3’端的互补碱基最大数目在4～10之间。
59、根据本发明的一个优选方案，本发明中的引物设计，在常规pcr条件下(包括但不限于na+离子浓度为0.18m，温度为60℃)，结合自由能δg在-4kcal/mol～-20kcal/mol。
60、本发明设计的核酸抑制探针3’端的封闭基团包括但不限于磷酸化修饰、c3间臂、pna、lna、以及封闭基团包括但不限于磷酸化修饰、间臂、pna、lna以及dxxdm。
61、本发明所述引物设计方法使用但不限primer blast对引物的扩增特异性进行验证。
62、根据本发明的一个优选方案，测序技术包括但不限于sanger测序技术。
63、根据本发明的第二方面，提供一种如上面所述的基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术在肿瘤突变检测、实验室细胞系污染鉴定、基因分型与定量、遗传检测、伴随诊断中的应用。
64、众所周知的是，在科研领域，实验室细胞系污染已成为一个不容忽视的问题。污染的细胞系可能导致实验数据失真，严重影响研究结论的准确性和可信度。因此，准确、快速地鉴定实验室细胞系污染对于确保科研数据的真实性和可靠性至关重要。本发明通过优化多重qpcr技术，结合先进的测序和ai解谱分析方法，可用于实验室细胞系污染鉴定。在临床医学领域，肿瘤突变检测对于癌症的早期筛查、治疗方案的制定以及患者生存率的提高具有重要意义。
65、本发明的关键发明点在于，使用特异性引物(rp)、通用引物(up)以及多重核酸抑制探针置换扩增技术，通过qpcr富集多重dna靶标，配合ai图谱解析技术，仅一次测序即可精准确定多重产物中的多重突变序列。多重核酸抑制探针置换扩增技术是根据野生型模板序列设计核酸抑制探针，从而抑制野生型模板的扩增，而突变型模板因与抑制探针存在错配，在qpcr每轮扩增过程中被有效富集。本发明首次将ai图谱解析技术应用于单管多重qpcr突变放大检测，并且将基于qpcr的核酸抑制探针置换扩增突变放大技术、测序、ai解谱以及机器学习相结合，实现单管多重qpcr突变放大检测。本发明中的多重核酸抑制探针置换扩增技术与ai解析图谱技术相辅相成，基于qpcr的多重核酸抑制探针置换扩增使得扩增产物仅为突变型，从而降低混合图谱解谱的复杂程度，ai解析图谱可以确定突变序列；qpcr技术操作简便、快速，结合多重核酸抑制探针设计，可以单次反应检测数百个潜在突变位点。通过监测ct值的变化，能够快速初步判断是否存在相关突变，大大提高了筛查效率。
66、根据本发明提供的这样一种基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术，主要特点在于：1)采用基于qpcr的多重核酸抑制探针置换扩增技术，有效放大突变信号，同时根据qpcr的ct值对样品进行突变粗筛；2)结合通用引物测序及混谱解析技术，确定突变序列；3)多重核酸抑制探针置换扩增技术与ai解析图谱技术相互协同，由于抑制探针置换扩增后产物主要为突变型，这大大降低了混合图谱解谱的复杂性，而ai解析图谱则能精准确定突变序列。
67、根据本发明提供的方法，相对于现有技术的有益效果如下：
68、高灵敏度和低检测限：利用特异性引物和通用引物与抑制探针相结合的方式，可在qpcr扩增过程中有效抑制野生型模板的扩增，从而选择性地放大突变型模板。基于qpcr的单重核酸抑制探针置换扩增技术可检测到0.01％的低频率突变，多重可用于高通量检测dna突变，例如，基于单管qpcr的16重核酸抑制探针置换扩增技术可覆盖检测342个突变位点，最低检测限为0.2％，基于单管qpcr的12重核酸抑制探针置换扩增技术可覆盖检测结直肠癌201个基因突变位点。
69、精准鉴定突变序列：通过将基于qpcr的多重核酸抑制探针置换扩增产物进行测序，并与dna序列库比对，可精确解析出样本中所含有的具体序列。这种结合qpcr和测序的方式，不仅可以快速初筛突变，还能确定突变的序列，大大降低了混合图谱解析的复杂度。
70、应用范围广泛：本发明可用于检测实验室细胞系污染、肿瘤组织和血液中的循环游离dna(cfdna)突变等，覆盖了科研和临床诊断的多个领域，具有广阔的应用前景。
71、综上所述，本发明提供了一种高灵敏、高通量、操作简便、成本经济的低频突变检测方案，适用于实验室细胞系污染鉴定、血液cfdna以及肿瘤组织突变检测等多种应用场景，能够实现对肿瘤基因突变的准确、快速检测，为癌症的早期诊断和治疗提供有力支持。
1.一种基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术，其特征在于，步骤s1、s2包括：针对野生型dna模板设计多重核酸抑制探针，通过基于qpcr的核酸抑制探针置换扩增技术，使得野生型dna模板被抑制而突变型dna模板正常扩增，采用特异性反向引物测序获取突变型的单一序列，采用通用引物测序获取突变型的混合序列，根据qpcr扩增ct值的变化实现突变的初筛。
3.根据权利要求1所述的基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术，其特征在于，步骤s3中，所述ai图谱解析技术采用动态时间规整算法及点对点比对算法来计算相似性。
4.根据权利要求3所述的基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术，其特征在于，所述动态时间规整算法包括：dtw单谱随机组合比对算法、dtw单谱逐步比对叠加算法。
5.根据权利要求4所述的基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术，其特征在于，dtw单谱随机组合比对算法的解析流程如下：
6.根据权利要求4所述的基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术，其特征在于，所述dtw单谱逐步比对叠加算法的解析流程如下：
7.根据权利要求3所述的基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术，其特征在于，所述点对点比对算法的解析流程如下：
8.根据权利要求3所述的基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术，其特征在于，步骤s3中，所述ai图谱解析技术还包括构建一个混合图谱解析模型，使该模型能够自主学习并有效地识别混合图谱中的突变序列，其中，机器学习的解析流程如下：
9.根据权利要求1所述的基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术，其特征在于，步骤s1、s2中，采用长片段核酸抑制探针使富集区间最长可达44nt，实现突变的高通量放大检测。
10.一种根据权利要求1-9中任意一项所述的基于ai图谱解析的单管多重qpcr突变放大检测技术的应用，其特征在于，所述应用包括：肿瘤突变检测、实验室细胞系污染鉴定、基因分型与定量、遗传检测、伴随诊断。
