本发明是一种鸡传染性贫血病毒vp1重组蛋白、单克隆抗体、阻断elisa试剂盒及其制备方法，具体涉及一种表达鸡传染性贫血病毒的his-vp1和strepii-vp1重组蛋白、基于该重组蛋白的单克隆抗体、阻断elisa试剂盒及其制备方法，属于生物医药。
背景技术：
1、鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus，ciav)是一种对3周龄以下的雏鸡和老年鸡造成严重免疫抑制的病原体，现有研究发现，ciav高致病性毒株感染10周龄成年鸡后也会发生明显临床症状。ciav感染引发的关键病理变化主要包括骨髓造血组织的损伤以及免疫器官(特别是胸腺和法氏囊)的萎缩，导致免疫功能抑制及再生障碍性贫血。这种免疫抑制使得鸡只更易受其他病原体的感染，如传染性法氏囊病病毒(ibdv)、马立克氏病病毒(mdv)或网状内皮组织增生症病毒(rev)等，增加了混合感染和疫苗免疫失败的风险，使饲料转化率不良，威胁到鸡只的健康和福利，对全球家禽业产生了巨大的影响，导致了养禽业严重的经济损失。
2、1979年，ciav由日本的yuasa等研究人员在受污染的疫苗中首次发现，该病毒引起的疾病主要表现为雏鸡的贫血和免疫抑制，引起了科学界的广泛关注。ciav只有一个血清型，是指环病毒科(anelloviridae)环状病毒属(gyrovirus)的唯一成员，为无囊膜单链环状dna病毒，病毒颗粒的直径大约在29.1nm至26.5nm之间，ciav的衣壳由12个五边形的喇叭状单元组成，这些单元在电子显微镜下呈现出鲜明的突出形态。ciav感染于1996年首次在中国被报告。迄今为止，中国大部分地区可以在鸡群中检测到该病毒，导致了家禽养殖业的重大经济损失。sun等从中国17个省的197个肉鸡养殖场收集了2020-2021年的573份临床样本，其中375例样本ciav检测呈阳性(65.4％)，不同地区检出ciav的阳性率有所不同，中国北部为46.67％，中国南部为81.25％，说明该病毒在我国普遍存在。ciav在鸡群中可水平和垂直传播。粪-口途径已被证明是ciav水平传播的途径主要，感染鸡的粪便是病毒在鸡群中水平传播的主要来源，此外阳性鸡的羽毛也可作为潜在传染源传播病毒。ciav最重要的传播方式是通过种蛋垂直传播，hoop等人证实感染ciav的母鸡和ciav阳性公鸡的精液是垂直传播的传染源，可持续垂直传播长达6周。研究表明，即使感染ciav后的母鸡产生免疫反应并形成了抗体，垂直传播的可能性仍然存在。具有高滴度中和抗体的母鸡的后代，由于体内存在来自母源抗体的保护，可能不会出现临床症状，但在这些后代中仍然可以检测到ciav的dna。由于ciav是垂直传播并存在于许多spf鸡群中，因此ciav的另一种传播方式是通过受污染的疫苗，ciav与活疫苗一起被注射进入鸡体内，在机体内恢复毒力并造成病毒感染，因此有必要采取一定的质量控制措施对疫苗进行监测，控制ciav的进一步流行。
3、ciav最主要的传播方式是垂直传播，目前，唯一有效的控制手段是将家禽生物安全措施与疫苗接种相结合。针对ciav的商业化疫苗主要是减毒活疫苗，但接种ciav疫苗的必要性并未得到普遍认可，因为疫苗成本较高且活疫苗有一定返强风险，有引进疫苗毒株的可能。所以定期监测鸡群ciav的抗体水平，将阳性鸡及时淘汰无害化处理，周围鸡群隔离饲养，是大多鸡场阻止疾病的进一步传播的措施。各国在众多检测方法中，elisa检测方法以其敏感、特异、操作方便而被广泛应用于临床检测。该法适合于基层兽医部门和鸡场对该病的诊断和血清学检测。很多学者先后建立了多种检测ciav血清抗体的方法，但均未商品化，目前常见的ciav商品化elisa试剂盒有四种，均为进口试剂盒：x-ovo的flockscreenelisa、zoetis的proflok chicken anemia virus(cav)antibody test kit、biochek的ck126 cav和idexx的flockcheck cav elisa，前三者为间接elisa，idexx的为阻断elisa。因此，研制具有我国自主知识产权的鸡传染性贫血病毒血清抗体检测试剂盒，并将其产业化生产，对于我国鸡传染性贫血的净化具有重要的意义。
4、vp1蛋白作为ciav的唯一结构蛋白，在病毒的感染与复制中扮演着关键角色，并且是唯一具有病毒中和表位的蛋白。因此，vp1蛋白是了解ciav致病机理、分离特征、流行病学及开发诊断试剂的重要蛋白。现有技术中，中国专利cn116813717a公开了一种基于病毒样颗粒的检测鸡传染性贫血病毒抗体的包被抗原、elisa试剂盒及其应用，采用鸡传染性贫血病毒样颗粒重组vp1蛋白为包被抗原，其中，重组vp1蛋白通过设计的扩增引物将vp1目基因连接至pgex-4t-1骨架载体上，再利用大肠杆菌bl21(de3)表达纯化而得到，由于病毒样颗粒具有和原始病毒相似的外部结构，更适合用于血清学诊断方法的开发，能够高效检测养殖场鸡群的ciav抗体。该专利cn116813717a是间接elisa，检测方法涉及到一个额外的步骤，使用另一种抗体即一种特异性结合于抗原抗体复合物的二抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡igg抗体，因此极易产生交叉反应，可能增强非特异性结合和背景信号。而阻断elisa降低了非特异性背景信号的干扰，酶标检测抗体不与样本血清抗体结合，具有更低的背景信号。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种鸡传染性贫血病毒vp1重组蛋白、单克隆抗体、阻断elisa试剂盒及其制备方法，以pcold-his-tf-vp1和pcold-his-tf-vp1为原核表达载体建立鸡传染性贫血病毒相关的重组蛋白his-vp1和strepii-vp1，能够帮助vp1的表达，有助于免疫后产生更好的免疫反应，产生抗原表位正确的单克隆抗体，进一步的，表位正确且亲和力适当的单克隆抗体能够作为开发阻断elisa试剂盒的基础，因此，可为检测或诊断鸡传染性贫血病毒的研究奠定基础。
2、本发明包括以下技术方案：
3、(一)一种鸡传染性贫血病毒vp1重组蛋白，包括his-vp1重组蛋白和strepii-vp1重组蛋白，
4、所述his-vp1重组蛋白由原核表达载体pcold-his-tf-vp1经诱导表达而获得，his-vp1重组蛋白的序列如seq id no：1所示；
5、所述strepii-vp1重组蛋白由原核表达载体pet-twinstrepii-sumo-vp1经诱导表达而获得，strepii-vp1重组蛋白的序列如seq id no：2所示。
6、其中，seq id no：1为：
7、atgaatcacaaagtgcatcatcatcatcatcacatgcaagtttcagttgaaaccactcaaggccttggccgccgtgtaacgattactatcgctgctgacagcatcgagaccgctgttaaaagcgagctggtcaacgttgcgaaaaaagtacgtattgacggcttccgcaagggcaaagtgccaatgaatatcgttgctcagcgttatggcgcgtctgtacgccaggacgttctgggtgacctgatgagccgtaacttcattgacgccatcattaaagaaaaaatcaatccggctggcgcaccgacttatgttccgggcgaatacaagctgggtgaagacttcacttactctgtagagtttgaagtttatccggaagttgaactgcaaggtctggaagcgatcgaagttgaaaaaccgatcgttgaagtgaccgacgctgacgttgacggcatgctggatactctgcgtaaacagcaggcgacctggaaagaaaaagacggcgctgttgaagcagaagaccgcgtgaccatcgacttcaccggttctgtagacggcgaagagttcgaaggcggtaaagcgtctgatttcgtactggcgatgggccagggtcgtatgatcccgggctttgaagacggtatcaaaggccacaaagctggcgaagagttcaccatcgacgtgaccttcccggaagaataccacgcagaaaacctgaaaggtaaagcagcgaaattcgctatcaacctgaagaaagttgaagagcgtgaactgccggaactgaccgcagagttcatcaaacgtttcggcgttgaagatggttccgtagaaggtctgcgcgctgaagtgcgtaaaaacatggagcgcgagctgaagagcgccatccgtaaccgcgttaagtctcaggcgatcgaaggtctggtaaaagctaacgacatcgacgtaccggctgcgctgatcgacagcgaaatcgacgttctgcgtcgccaggctgcacagcgtttcggtggcaacgaaaaacaagctctggaactgccgcgcgaactgttcgaagaacaggctaaacgccgcgtagttgttggcctgctgctgggcgaagttatccgcaccaacgagctgaaagctgacgaagagcgcgtgaaaggcctgatcgaagagatgg cttctgcgtacgaagatccgaaagaagttatcgagttctacagcaaaaacaaagaactgatggacaacatgcgcaatgttgctctggaagaacaggctgttgaagctgtactggcgaaagcgaaagtgactgaaaaagaaaccactttcaacgagctgatgaaccagcaggcgtccgcgggtctggaagttctgttccaggggccctccgcgggtctggtgccacgcggtagtggtggtatcgaaggtaggcatatggagctcggtaccctcgagatggcaagacgagctcgcagaccgagaggccgattttactccttcagaagaggacggtggcaccacctcaagcgacttcgacgaagatataaatttcgacatcggaggagacagcggtatcgtagacgagcttttaggaaggcctttcacaacccccgccccggtacgtatagtgtgaggctgccgaacccccaatctactatgactatccgcttccaaggggtcatctttctcacggaaggactcattctgcctaaaaacagcacagcggggggctatgcagaccacatgtacggggcgagagtcgccaagatctctgtgaacctgaaagagttcctgctagcctcaatgaacctgacatacgtgagcaaaatcggaggccccatcgccggtgagttgattgcggacgggtctaaatcacaagccgcggacaattggcctaattgctggctgccgctagataataacgtgccctccgctacaccatcggcatggtggagatgggccttaatgatgatgcagcccacggactcttgccggttctttaatcacccaaagcagatgaccctgcaagacatgggtcgcatgtttgggggctggcacctgttccgacacattgaaacccgctttcagctccttgccactaagaatgagggatccttcagccccgtggcgagtcttctctcccagggagagtacctcacgcgtcgggacgatgttaagtacagcagcgatcaccagaaccggtggcaaaaaggcggacaaccgatgacggggggcattgcttatgcgaccgggaaaatgagacccgacgagcaacagtaccctgctatgcccccagaccccccgatcatcaccgctactacagcgcaaggcacgcaagtccgctgcatgaatagcacgcaagcttggtggtcatgggacacatatatgagctttgcaacactcacagcactcggtgcacaatggtcttttcctccagggcaacgttcagtttctagacggtccttcaaccaccacaaggcgagaggagccggggaccccaagggccagagatggcacacgctggtgccgctcggcacggagaccatcaccgacagctacatgtcagcacccgcatcagagctggacactaatttctttacgctttacgtagcgcaaggcacaaataagtcgcaacagtacaagttcggcacagctacatacgcgctaaaggagccggtaatgaagagcgatgcatgggcagtggtacgcgtccagtcggtctggcagctgggtaacaggcagaggccatacccatgggacgtcaactgggcgaacagcaccatgtactgggggacgcagccctg；
8、seq id no：2为：
9、atgagcgcctggagccacccgcagttcgaaaaaggcggcggcagcggcggcggcagcggcggcagcgcctggagccacccgcagttcgaaaaacatatggctagcatgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatgg actccttaagattcttgtacgacggtattagaatccaagctgatcagacccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggatccgtcgacgaattcatggcaagacgagctcgcagaccgagaggccgattttactccttcagaagaggacggtggcaccacctcaagcgacttcgacgaagatataaatttcgacatcggaggagacagcggtatcgtagacgagcttttaggaaggcctttcacaacccccgccccggtacgtatagtgtgaggctgccgaacccccaatctactatgactatccgcttccaaggggtcatctttctcacggaaggactcattctgcctaaaaacagcacagcggggggctatgcagaccacatgtacggggcgagagtcgccaagatctctgtgaacctgaaagagttcctgctagcctcaatgaacctgacatacgtgagcaaaatcggaggccccatcgccggtgagttgattgcggacgggtctaaatcacaagccgcggacaattggcctaattgctggctgccgctagataataacgtgccctccgctacaccatcggcatggtggagatgggccttaatgatgatgcagcccacggactcttgccggttctttaatcacccaaagcagatgaccctgcaagacatgggtcgcatgtttgggggctggcacctgttccgacacattgaaacccgctttcagctccttgccactaagaatgagggatccttcagccccgtggcgagtcttctctcccagggagagtacctcacgcgtcgggacgatgttaagtacagcagcgatcaccagaaccggtggcaaaaaggcggacaaccgatgacggggggcattgcttatgcgaccgggaaaatgagacccgacgagcaacagtaccctgctatgcccccagaccccccgatcatcaccgctactacagcgcaaggcacgcaagtccgctgcatgaatagcacgcaagcttggtggtcatgggacacatatatgagctttgcaacactcacagcactcggtgcacaatggtcttttcctccagggcaacgttcagtttctagacggtccttcaaccaccacaaggcgagaggagccggggaccccaagggccagagatggcacacgctggtgccgctcggcacggagaccatcaccgacagctacatgtcagcacccgcatcagagctggacactaatttctttacgctttacgtagcgcaaggcacaaataagtcgcaacagtacaagttcggcacagctacatacgcgctaaaggagccggtaatgaagagcgatgcatgggcagtggtacgcgtccagtcggtctggcagctgggtaacaggcagaggccatacccatgggacgtcaactgggcgaacagcaccatgtactgggggacgcagccctga。
10、进一步的，构建原核表达载体pcold-his-tf-vp1的扩增引物的序列如seq id no：3和seq id no：4所示；构建pet-twinstrepii-sumo-vp1的扩增引物的序列如seq id no：5和seq id no：6所示。
11、其中，seq id no：3(上游引物)为5’-atggagctcggtaccctcgagatggcaagacgag-3’；seq id no：4(下游引物)为5’-agcagagattacctatctagatcagggctgcgtc-3’；seq id no：5(上游引物)为5’-gatccgtcgacgaattcatggcaagacg-3’；seq id no：6(下游引物)为5’-agccggatctcactcgagtcagggctg-3’。
12、(二)一种如上述鸡传染性贫血病毒vp1重组蛋白的制备方法，将vp1基因分别构建到表达载体pcold-his-tf和pet-twinstrepii-sumo，得到原核表达载体pcold-his-tf-vp1和原核表达载体pet-twinstrepii-sumo-vp1，经诱导表达后，得到his-vp1重组蛋白和strepii-vp1重组蛋白。
13、进一步的，构建表达载体pet-twinstrepii-sumo的扩增引物的序列如seq id no：7和seq id no：8所示。
14、seq id no：7(上游引物)为5’-agaaggagatatacatatgagcgcctggag-3’；seq idno：8(下游引物)为5’-acatgctagccatatgtttttcgaactg-3’。
15、优选的，将所述原核表达载体pcold-his-tf-vp1和原核表达载体pet-twinstrepii-sumo-vp1分别转化到大肠杆菌感受态细胞中进行诱导表达，例如transetta感受态细胞。
16、诱导表达时，将所述原核表达载体pcold-his-tf-vp1的菌液涂布于lba固体培养基上；将所述原核表达载体pet-twinstrepii-sumo-vp1的菌液涂布于lbk固体培养基上。
17、(三)一种抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体的制备方法，利用上述的his-vp1重组蛋白经免疫反应、细胞融合、筛选而得到阳性杂交瘤细胞株4c11和5c11。
18、(四)一种如上述制备方法制得的抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体。
19、免疫balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤sp2/0细胞融合，多次亚克隆获得稳定分泌抗vp1抗体的杂交瘤细胞。
20、(五)一种检测鸡传染性贫血病毒抗体的阻断elisa试剂盒，包括上述的his-vp1重组蛋白，以及抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体，除此之外，还包括抗原包被原液、血清抗体稀释液、终止液等相关试剂。
21、进一步的，在所述阻断elisa试剂盒中，所述的his-vp1重组蛋白为包被抗原，所述的抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体为检测抗体。
22、本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
23、(1)本发明基于ciav的vp1基因序列设计了一种以pet-twinstrepii-sumo或pcold-his-tf为表达载体的质粒，该质粒通过大肠杆菌表达系统进行诱导表达，可以得到his-vp1和strepii-vp1的两种重组蛋白，其中，带有不同助溶标签的质粒可以更好的帮助vp1表达在上清，有助于免疫小鼠后产生更好的免疫反应，产生抗原表位正确的单克隆抗体，其次，大肠杆菌表达系统在表达异源重组蛋白时具有多种优势，包括成本效益高、节省时间、易于生产以及更容易确认重组蛋白的抗原特征。等等，因此，表位正确且亲和力适当的单克隆抗体也是开发阻断elisa试剂盒的基础。
24、(2)本发明提供了以原核表达的his-vp1重组蛋白和strepii-vp1重组蛋白，可用于发开发诊断试剂盒，建立ciav血清抗体阻断elisa检测试剂盒，在elisa试剂盒中，将strepii-vp1重组蛋白作为包被抗原，将his-vp1重组蛋白免疫标记的阳性杂交瘤细胞株4c11单克隆抗体作为检测抗体，实现了鸡传染性贫血病毒elisa检测试剂盒的国产化，降低了采用进口elisa试剂盒进行检测的高昂成本，不仅可以用于ciav感染的早期诊断，也适用于评估预防性疫苗的效果。
1.一种鸡传染性贫血病毒vp1重组蛋白，其特征在于：包括his-vp1重组蛋白和strepii-vp1重组蛋白，
2.根据权利要求1所述的vp1重组蛋白，其特征在于：构建原核表达载体pcold-his-tf-vp1的扩增引物的序列如seq id no：3和seq id no：4所示；构建pet-twinstrepii-sumo-vp1的扩增引物的序列如seq id no：5和seq id no：6所示。
3.一种如权利要求1或2任一项所述鸡传染性贫血病毒vp1重组蛋白的制备方法，其特征在于：将vp1基因分别构建到表达载体pcold-his-tf和pet-twinstrepii-sumo，得到原核表达载体pcold-his-tf-vp1和原核表达载体pet-twinstrepii-sumo-vp1，经诱导表达后，得到his-vp1重组蛋白和strepii-vp1重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：构建表达载体pet-twinstrepii-sumo的扩增引物的序列如seq id no：7和seq id no：8所示。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：将所述原核表达载体pcold-his-tf-vp1和原核表达载体pet-twinstrepii-sumo-vp1分别转化到大肠杆菌感受态细胞中进行诱导表达。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：诱导表达时，将所述原核表达载体pcold-his-tf-vp1的菌液涂布于lba固体培养基上；将所述原核表达载体pet-twinstrepii-sumo-vp1的菌液涂布于lbk固体培养基上。
7.一种抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于：利用权利要求1或2所述的his-vp1重组蛋白经免疫反应、细胞融合、筛选而得到阳性杂交瘤细胞株4c11和5c11。
8.一种如权利要求7所述制备方法制得的抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体。
9.一种检测鸡传染性贫血病毒抗体的阻断elisa试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的his-vp1重组蛋白，以及权利要求8所述的抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的阻断elisa试剂盒，其特征在于：所述的his-vp1重组蛋白为包被抗原，所述的抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体为检测抗体。
