本发明涉及生物诊断，特别涉及一种基于一锅法mira扩增crispr切割的gbs检测组合物、系统及方法。
背景技术：
1、b族链球菌(group bstreptococcus，简称gbs)是一种定植于人类生殖道和胃肠道的革兰阳性球菌，部分定植于儿童和成人的上呼吸道，对孕妇和新生儿的健康构成威胁。多年来，大量研究表明gbs感染是新生儿早期感染的主要危险因素，大约50％的gbs阳性孕妇会将感染传染给其新生儿，在这些病例中，1％-2％会导致新生儿早发型gbs感染，典型表现为败血症、肺炎和脑膜炎，严重威胁其生命，死亡率高达5％。因此，在分娩前，需对围产期孕妇行b族链球菌筛查，并根据筛查结果给孕妇提供针对性的防治措施，从而最大限度地降低胎膜早破、早产及围产儿死亡的发生率，进而使母婴受生殖道感染的危害降至最低，改善母婴生存质量。
2、成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，简称crispr)及其相关蛋白系统(crispr/cas)为病原体的灵敏和特异性分子检测提供了新的机会。在crispr家族中，cas12a具有利用定制的crispr rna(crrna)进行编程，识别并顺式切割特定核酸序列的能力。在识别序列后，cas12a表现出非特异性侧链切割(反式切割)活性，以切割周围的单链dna(ssdna)。这种独特的特性可以用于扩增核酸的检测。近年来，结合cas酶已开发出多种具有高灵敏度、特异性和准确性的基于crispr的核酸检测平台。
3、通常的基因检测技术流程包括核酸提取与扩增，之后对扩增产物进行检测，常见的技术有荧光定量pcr、环介导等温扩增(lamp)等等，具有较高的灵敏度和满意的准确性。然而，基于pcr的检测技术对昂贵设备和高度专业化人员的依赖，阻碍了gbs在基层卫生所等更广泛场景中的检测，难以实现简单、快速、即时的poc分子诊断。以lamp为代表的等温扩增技术受制于核酸扩增原理，容易产生假阳性现象，阻碍其进一步应用。将等温扩增技术与crispr检测技术结合起来可以同时实现高灵敏度和高特异性，且无需过多的设备与工序，但是，核酸扩增与crispr切割反应存在一定的互斥性，因此需要先进行扩增再进行crispr检测，需要进行溶液转移和反应管开盖，容易造成环境气溶胶污染和试剂二次污染。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于一锅法mira扩增crispr切割的gbs检测组合物、系统及方法。本发明采用在crispr体系中可识别次优pam序列的crrna代替可识别经典pam序列的crrna，将mira等温扩增与crispr结合到一管中，并无需核酸洗涤、洗脱等步骤，直接将裂解后的样本加入到体系中即可开始反应，只需要加热，无需进行溶液转移、设备操作等复杂工序即可完成gbs高效、高灵敏、高特异地检测。
2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
3、本发明的第一方面，提供一种基于一锅法mira扩增crispr切割的gbs检测组合物，包括：mira扩增反应体系、gbs扩增引物、lbcas12a酶、识别gbs核酸靶序列上次优pam序列的crrna、ssdna报告子。
4、优选的是，gbs检测组合物总体积为30-200μl，加入的样本量为体系总体积的5-10％。
5、优选的是，所述mira扩增反应体系包括：200-300ng/μl重组酶、200-300ng/μl重组酶辅因子、600-800ng/μl单链dna结合蛋白、100-200ng/μldna聚合酶、200-400ng/μl肌酸激酶、30-50mm tris-hcl和20-100mm醋酸钾、20-100mm醋酸镁、20-100mm磷酸肌酸、1-6mm三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、200-400μm dntps、1-4mm atp、8％-10％w/v聚乙二醇10000和1-4％w/v聚乙烯吡咯烷酮。
6、优选的是，所述gbs扩增引物用于对gbs camp基因中的靶序列进行扩增，该靶序列的基于序列为seq id no.1：
7、tgccaaccctgagacagtttatgatttgaattctattggtagtcgtgtagaagccttaacagatgtgattgaagcaatcactttttcaactcaacatttaacaaataaggttagtcaagcaaatattgatatgggatttgggataactaagctagttattcgcattttagatccatttgcttcagttgattcaattaaagctcaagttaacgatgtaaaggcattagaacaaaaagttttaacttatcctgatttaaaaccaactgatagag；
8、gbs扩增引物包括gbs上游引物和gbs下游引物；
9、gbs上游引物序列为seq id no.2：
10、tgccaaccctgagacagtttatgatttgaa；
11、gbs下游引物序列为seq id no.3：
12、ctctatcagttggttttaaatcaggataag。
13、优选的是，gbs上游引物和gbs下游引各0.2-0.5μm。
14、优选的是，pam序列为seq id no.4：ctta；该pam序列相比于传统的pam序列(tttn)拥有较低的效率，有利于mira扩增和crispr切割同时进行。
15、crrna序列为seq id no.5：
16、uaauuucuacuaaguguagauacagaugugauugaagcaau。
17、优选的是，crrna浓度为50-200nm，crrna与lbcas12a酶浓度比为1：1。
18、优选的是，ssdna报告子序列为seq id no.5：ttatt；ssdna报告子的5’端标记一个荧光素fam、3’端标记一个bhq1或biotin。
19、本发明的第二方面，提供一种基于一锅法mira扩增crispr切割的gbs检测系统，该系统包括如上所述的gbs检测组合物和荧光检测设备，所述荧光检测设备通过对反应产物进行荧光强度检测来判断是否存在gbs，其中，ssdna报告子的5’端标记一个荧光素fam、3’端标记一个bhq1。
20、优选的是，荧光检测设备可以为实时荧光检测仪或终点荧光强度检测设备。
21、本发明的第三方面，提供一种本发明的第二方面提供的系统的检测方法，包括以下步骤：
22、s1、将待测样品与核酸释放剂混合后作为样本溶液；
23、s2、将样本溶液加入到如权利要求1-6中任意一项所述的gbs检测组合物中，样本溶液的加入量为gbs检测组合物总体积的5-10％；
24、s3、恒温扩增，反应结束后采用荧光检测设备对反应产物溶液进行荧光检测，以判断待测样品中是否含有gbs。例如，采用实时荧光检测仪检测时，最后出现“s”型荧光曲线则表示该次测试样本为阳性，未出现“s”型荧光曲线则表示该次测试样本为阴性。
25、优选的是，所述核酸释放剂主要成分为60-100mm tris-hcl、50-100mm edta、1％-4％吐温、1-2mm盐酸胍、1-2mm异硫氰酸胍、0.5-2m nacl、2％-4％十二烷基硫酸钠、2-4％十二烷基肌氨酸钠、水，裂解液体积200-800μl。
26、本发明的第四方面，提供另一种基于一锅法mira扩增crispr切割的gbs检测系统，该系统包括如上所述的gbs检测组合物和能够检测crispr切割产物的核酸试纸条，所述核酸试纸条的质控线(c线)划有链霉亲和素，检测线(t线)划有抗鼠抗体，样品垫上负载有抗fam抗体标记的胶体金；
27、其中，ssdna报告子的5’端标记一个荧光素fam、3’端标记一个biotin。
28、本发明的第五方面，提供一种如本发明的第四方面提供的系统的检测方法，包括以下步骤：
29、s1、将待测样品与核酸释放剂混合后作为样本溶液；
30、s2、将样本溶液加入到如权利要求1-6中任意一项所述的gbs检测组合物中，样本溶液的加入量为gbs检测组合物总体积的5-10％；
31、s3、恒温扩增，反应结束后取反应产物，稀释后滴加到核酸试纸条的样品垫上，观察质控线和检测线的颜色，以判断待测样品中是否含有gbs：若质控线显色、检测线不显色，则表示待测样品中无gbs；若质控线、检测线均显色，或检测线显色、质控线不显色，则表示待测样品中含有gbs；若质控线、检测线均不显色，则表示检测结果有误，需重新检测。
32、在检测产物时，将一步法mira扩增/crispr切割体系产物稀释10-20倍后转移至试纸条样品垫上。阴性样本中的报告子(fam-ttatt-biotin)与结合垫上的金标-抗fam结合后向前层析，在c线处被链霉亲和素捕获从而c线显色；阳性样本中存在被切割后的报告子，其中fam-断链与金标-抗fam抗体结合后向前层析并被t线处的抗鼠抗体捕获从而t线显色，没有被切割的报告子则结合金标-抗fam并在c线处被捕获。
33、本发明的有益效果是：
34、本发明提供了一种基于一锅法mira扩增crispr切割的gbs检测组合物、基于该组合物的检测系统以及检测方法，本发明结合核酸免提取mira等温扩增体系和crispr-cas12a切割反应体系，将两个体系整合至一个反应管，包括cas12a酶、识别次优pam序列的crrna、ssdna报告子、mira等温扩增试剂和反应酶、扩增引物等，可用于简单、快速、准确的gbs检测。其检测灵敏度可达到3.2copies/μl，在恒温39℃环境下即可完成整个检测工序，检测操作便携且高效，能在短时间内得到检测结果，且具有较高的特异性。
35、本发明并无需核酸洗涤、洗脱等步骤，直接将裂解后的样本加入到体系中即可开始反应，只需要加热，无需进行溶液转移、设备操作等复杂工序即可完成gbs高效、高灵敏、高特异地检测；本发明拥有较高的应用价值，可检测临床样本，可成为检测围产期孕妇gbs感染的一种新型技术。
1.一种基于一锅法mira扩增crispr切割的gbs检测组合物，其特征在于，包括：mira扩增反应体系、gbs扩增引物、lbcas12a酶、识别gbs核酸靶序列上次优pam序列的crrna、ssdna报告子。
2.根据权利要求1所述的基于一锅法mira扩增crispr切割的gbs检测组合物，其特征在于，所述mira扩增反应体系包括：200-300ng/μl重组酶、200-300ng/μl重组酶辅因子、600-800ng/μl单链dna结合蛋白、100-200ng/μldna聚合酶、200-400ng/μl肌酸激酶、30-50mmtris-hcl和20-100mm醋酸钾、20-100mm醋酸镁、20-100mm磷酸肌酸、1-6mm三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、200-400μm dntps、1-4mm atp、8％-10％w/v聚乙二醇10000和1-4％w/v聚乙烯吡咯烷酮。
3.根据权利要求1所述的基于一锅法mira扩增crispr切割的gbs检测组合物，其特征在于，所述gbs扩增引物用于对gbs camp基因中的靶序列进行扩增，该靶序列的基于序列为seq id no.1：
4.根据权利要求3所述的基于一锅法mira扩增crispr切割的gbs检测组合物，其特征在于，pam序列为seq id no.4：ctta；
5.根据权利要求4所述的基于一锅法mira扩增crispr切割的gbs检测组合物，其特征在于，crrna浓度为50-200nm，crrna与lbcas12a酶浓度比为1：1。
6.根据权利要求5所述的基于一锅法mira扩增crispr切割的gbs检测组合物，其特征在于，ssdna报告子序列为seq id no.5：ttatt；ssdna报告子的5’端标记一个荧光素fam、3’端标记一个bhq1或biotin。
7.一种基于一锅法mira扩增crispr切割的gbs检测系统，其特征在于，该系统包括如权利要求1-6中任意一项所述的gbs检测组合物和荧光检测设备，所述荧光检测设备通过对反应产物进行荧光强度检测来判断是否存在gbs，其中，ssdna报告子的5’端标记一个荧光素fam、3’端标记一个bhq1。
8.一种如权利要求7所述的系统的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.一种基于一锅法mira扩增crispr切割的gbs检测系统，其特征在于，该系统包括如权利要求1-6中任意一项所述的gbs检测组合物和能够检测crispr切割产物的核酸试纸条，所述核酸试纸条的质控线划有链霉亲和素，检测线划有抗鼠抗体，样品垫上负载有抗fam抗体标记的胶体金；
10.一种如权利要求9所述的系统的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
