本发明属基因工程及发酵工程，具体涉及一种高产视黄醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。
背景技术：
1、维生素a是一种脂溶性维生素，被称为“美容维生素”和“抗干眼病维生素”，广泛应用于饲料、医药化妆品和食品。生物活性形式是视黄醇、视黄醛和视黄酸，它们在生物体内可以相互转化，生理功能上，视黄醇和视黄醛能够维持正常的视觉，可以促进视觉细胞内感光色素的形成，调试眼睛适应外界光线强弱的能力，降低夜盲症和视力减退的发生，有助于多种眼疾(如眼球干燥与结膜炎等)的治疗；视黄醇也具有类固醇激素相似的作用，可促进糖蛋白的合成，促进机体生长和发育，强壮骨骼，维护头发牙齿和牙床的健康；视黄酸可以调控基因表达，减弱上皮细胞向鳞片状的分化，增加上皮生长因子的数量，维持上皮的完整与健全；维生素a也有一定的抗氧化作用，可以清除一些有害的自由基。在人体中，维生素a以棕榈酸酯、亚油酸酯或油酸酯的形式储存于肝脏中。
2、维生素a可从动物组织中提取，但步骤繁琐、提取率低、成本高。目前商业化的维生素a都是通过化学合成的，合成方法分为roche法和basf法，都以柠檬醛为中间体。柠檬醛受制于巴斯夫、日本第一制药等国际维生素中间体供应商。而且化学合成法能耗成本较高，而且需要复杂的纯化步骤并易产生有毒害的异构体以及一系列污染物。通过微生物将糖类等可再生的生物资源转化成维生素a，温和的反应条件和强的选择专一性使其能够实现绿色清洁生产，可以实现摆脱对石油资源的依赖。
3、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)是一种公认安全的好氧产油酵母，常见于高油脂高蛋白的物质中，如奶酪，乳制品和肉类香肠中，能生长在较宽的盐浓度和ph范围内，胞内有大量的脂质体，脂类积累可高达细胞干重的70％，能为亲油性产物如萜类物质提供足够的存储空间。且有内源的甲羟戊酸途径，能够合成类胡萝卜素的关键前体物质香叶基焦磷酸ggpp，并且细胞质中有巨大的乙酰辅酶a池和高流量的tca循环，能为萜类物质合成提供大量的前体物质，atp和还原力nadph，无酒精发酵生产路径，是萜类如β-胡萝卜素生产的理想菌株。在生物体中，β-胡萝卜素可由酶如单加氧酶blh裂解成两分子的视黄醛再经视黄醇脱氢酶或去饱和酶或其他醇脱氢酶可逆转化成视黄醇。
4、微生物发酵生产维生素a最大的瓶颈在于如何提高产量使其达到工业化水平，虽然目前有很多利用遗传改造微生物工程菌合成维生素a的报道，但改造解脂耶氏酵母产维生素a却鲜有报道，而且仅有报道的解脂耶氏酵母产维生素a只强化从乙酰辅酶a经甲羟戊酸到维生素a这一代谢通路的基因表达，没有考虑外源类胡萝卜素合成途径相关限速酶的选择、极易发生的菌丝化及油脂的积累对维生素a产量的影响，导致无法突破产量以满足工业生产的要求。本发明以期通过生物合成方法构建高效生产视黄醇的菌株，使其更具有产业化的价值。
技术实现思路
1、本发明旨在于针对现有技术中产视黄醇的类胡萝卜素合成途径相关限速酶活性较低、宿主易菌丝化、油脂易氧化降解等缺陷，提供一种高产视黄醇的解脂耶氏酵母工程菌及其应用，所述工程菌中包含β-胡萝卜素合成途径相关基因、β-胡萝卜素裂解成视黄醛的相关基因；并敲除了菌丝化相关基因以及脂质β氧化的相关基因。可有效实现视黄醇的高产(视黄醇的合成途径见图1)。
2、本发明第一方面的目的，在于提供一种可实现视黄醇高产的解脂耶氏酵母基因工程菌。
3、本发明第二方面的目的，在于提供一种sgrna。
4、本发明第三方面的目的，在于提供一种制备视黄醇的方法。
5、本发明地四方面的目的，在于提供本发明第一方面的解脂耶氏酵母基因工程菌在食品、化工或制药领域的应用。
6、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
7、本发明的第一个方面，提供一种可实现视黄醇高产的解脂耶氏酵母基因工程菌，所述基因工程菌以解脂耶氏酵母为出发菌株，在该工程菌株中进行菌丝化基因和脂质过氧化基因敲除，构建视黄醇合成途径，和/或强化解脂耶氏酵母内源的甲羟戊酸途径，和/或同时强化解脂耶氏酵母外源类胡萝卜素合成途径关键基因表达
8、在本发明一些实施方式中，所述敲除了的菌丝化相关基因为myh1以及脂质β氧化的相关基因为all8
9、在本发明一些实施方式中，所述在酵母细胞中构建的视黄醇合成途径相关基因包含β-胡萝卜素15，15’-单加氧酶基因blh，blh基因的优化序列如seq id no:59所示。
10、在本发明一些实施方式中，所述在酵母细胞中构建的内源甲羟戊酸途径相关基因包括催化乙酰辅酶a缩合成乙酰乙酰辅酶a的基因atob(cp001509.3:2216470-2217654)、催化乙酰乙酰辅酶a和乙酰辅酶a缩合成hmg-coa的基因hmgs(cp028459.1:3780129-3781469)、催化hmg-coa还原为甲羟戊酸的基因hmgr(cp028452.1:571078-572577)的一种或多种。
11、在本发明一些实施方式中，所述在酵母细胞中构建的胡萝卜素合成途径相关基因包括：催化甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因erg12(cp028449.1:2082357-2083706)、催化甲羟戊酸-5-磷酸生成甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因erg8(cp028452.1:748052-746796)、催化甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊二烯焦磷酸的基因erg19(cp028453.1:818770-819933)、催化异戊二烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi(cp028453.1:585662-584850)、催化异戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸生成法尼基焦磷酸的基因erg20(cp028452.1:673068-672034)、催化法尼基焦磷酸结合一分子异戊二烯焦磷酸生成双香叶基焦磷酸的基因ggs1(cp028451.1:2085775-2084792)、将外源的催化茄红素脱氢生成番茄红素的基因carb、催化两分子双香叶基焦磷酸生成茄红素以及催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素的基因carrp的一种或多种，其中carb基因的优化序列如seqid no:57所示，carrp基因的优化序列如seq id no:58所示。
12、在本发明一些实施方式中，所述基因工程菌以解脂耶氏酵母ztq5320(授权号为zl202011341160.4的发明专利中公开，保藏编号为cctcc no:m2020606)为出发菌株。
13、在本发明一些实施方式中，所述的基因blh来源于海洋细菌66a03；所述的基因carb和carrp来源于卷枝毛霉(rhizomucor circinelloides)。
14、在本发明一些实施方式中，所述blh来源于海洋细菌66a03。
15、在本发明一些实施方式中，所述atob来源于大肠杆菌bl21(de3)。
16、在本发明一些实施方式中，所述hmgs、thmgr、erg12、erg8、erg19、erg20和ggs1来源于解脂耶氏酵母polf。
17、在本发明一些实施方式中，为了确保每个基因可以在重组质粒中高效表达，每个基因的上游连接有启动子序列，下游连接终止子序列。
18、在本发明一些实施方式中，所述启动子序列包括但不限于：ptef、pexp、pfba和pgpd。
19、在本发明一些实施方式中，所述终止子序列包括但不限于：ticl、tlip、tidi、txpr2、tcyc1、mig1t。
20、在本发明一些实施方式中，利用核苷酸序列如seq id no:1或seq id no:2所示的sgrna对解脂耶氏酵母ztq5320进行基因敲除，即得到all8和myh1基因双敲除的解脂耶氏酵母菌ztq5320δall8δmyh1。
21、本发明第二方面，提供一种sgrna，核苷酸序列如seq id no:1或seq id no:2所示。
22、在本发明一些实施方式中，所述seq id no:1所示的sgrna靶向敲除all8基因。
23、在本发明一些实施方式中，所述seq id no:2所示的sgrna靶向敲除mhy1基因。
24、本发明的第三个方面，提供一种制备视黄醇的方法，包括将本发明第一方面的解脂耶氏酵母基因工程菌接种至培养基中发酵。
25、在本发明一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：
26、一级种子液的培养；
27、二级种子液的培养；
28、发酵罐的培养。
29、更具体地，所述方法包括以下步骤：
30、一级种子液的培养：将固体ypd平板上的重组菌株单菌落接种到含有液体培养基的锥形瓶中，28～32℃、摇床转速180～200rpm，培养24～50小时，得到一级种子液。
31、二级种子液的培养：将一级种子液按1％～5％(v/v)接种量转接到含有液体培养基的锥形瓶中，28～32℃、摇床转速180～200rpm，培养到od600达到10，得到二级种子液。
32、发酵罐的培养：将二级种子液按7％～10％(wt)接种量转接至含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵温度28～32℃、搅拌速度300～800rpm、通气量2～5l/min、ph6.5～7.0和溶氧25％以上的条件下培养，培养10～13小时后以60％葡萄糖储液和十二烷继续补料发酵260～300小时。
33、在本发明一些实施方式中，所述种子培养基的成分包括：10g/l酵母膏、20g/l蛋白胨和60g/l葡萄糖。
34、在本发明一些实施方式中，所述发酵罐培养基的成分包括：30g/l酵母膏、60g/l蛋白胨和100g/l葡萄糖。
35、在本发明一些实施方式中，所述发酵培养基中加入了十二烷，培养基与十二烷的体积比是1:10～1:1。产物视黄醇是亲脂性物质，且过量积累对细胞有毒害作用，胞内的视黄醇会被萃取到十二烷中，有利于产物不断地合成、分泌与积累。
36、本发明的第四个方面，提供本发明第一方面的解脂耶氏酵母工程菌在食品、化工或制药领域的应用。
37、本发明的有益效果是：
38、本发明提供了一种提高视黄醇高产的基因工程菌及其构建方法，该构建方法是以授权号为113151340的专利菌株解脂耶氏酵母(保藏号为cctcc no:m2020606)为出发珠菌，将外源的催化番茄红素脱氢生成番茄红素的基因carb、催化两分子双香叶基焦磷酸生成茄红素以及催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素的基因carrp以及β-胡萝卜素15，15’-单加氧酶bcmo编码基因整合到酵母基因组。过表达甲羟戊酸途径中的乙酰辅酶a合成酶基因atob、hmg-coa合成酶基因hmgs、hmg-coa还原酶基因thmgr。过表达内源类胡萝卜素合成途径中的将催化甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因erg12、催化甲羟戊酸-5-磷酸生成甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因erg8、催化甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊二烯焦磷酸的基因erg19、催化异戊二烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi、催化异戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸生成法尼基焦磷酸的基因erg20、催化法尼基焦磷酸结合一分子异戊二烯焦磷酸生成双香叶基焦磷酸的基因ggs1。敲除菌丝化基因mhy1及油脂氧化基因all8。5l发酵罐视黄醇产量达到6g/l，可显著实现视黄醇的高产。
1.一种可实现视黄醇高产的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以解脂耶氏酵母为出发菌株，在该工程菌株中进行菌丝化基因和脂质过氧化基因敲除，构建视黄醇合成途径，和/或强化解脂耶氏酵母内源的甲羟戊酸途径，和/或同时强化解脂耶氏酵母外源类胡萝卜素合成途径关键基因表达。
2.根据权利要求1所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述敲除了的菌丝化相关基因为myh1以及脂质β氧化的相关基因为all8。
3.根据权利要求1所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述在酵母细胞中构建的视黄醇合成途径相关基因包含β-胡萝卜素15，15’-单加氧酶基因blh，blh基因的优化序列如seq id no:59所示。
4.根据权利要求1所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述在酵母细胞中构建的内源甲羟戊酸途径相关基因包括催化乙酰辅酶a缩合成乙酰乙酰辅酶a的基因atob、催化乙酰乙酰辅酶a和乙酰辅酶a缩合成hmg-coa的基因hmgs、催化hmg-coa还原为甲羟戊酸的基因hmgr的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述在酵母细胞中构建的胡萝卜素合成途径相关基因包括：催化甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因erg12、催化甲羟戊酸-5-磷酸生成甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因erg8、催化甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊二烯焦磷酸的基因erg19、催化异戊二烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi、催化异戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸生成法尼基焦磷酸的基因erg20、催化法尼基焦磷酸结合一分子异戊二烯焦磷酸生成双香叶基焦磷酸的基因ggs1、将外源的催化茄红素脱氢生成番茄红素的基因carb、催化两分子双香叶基焦磷酸生成茄红素以及催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素的基因carrp的一种或多种，其中carb基因的优化序列如seq id no:57所示，carrp基因的优化序列如seq id no:58所示。
6.根据权利要求1-5任一项所述的解脂耶氏酵母工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以解脂耶氏酵母ztq5320为出发菌株。
7.根据权利要求3和5所述的解脂耶氏酵母工程菌，其特征在于，所述的基因blh来源于海洋细菌66a03；所述的基因carb和carrp来源于卷枝毛霉(rhizomucor circinelloides)。
8.一种sgrna，核苷酸序列如seq id no:1或seq id no:2所示。
9.一种生产视黄醇的方法，包括将权利要求2-6所述的重组工程菌接种至培养基中发酵，提取视黄醇。
10.权利要求1-6任一项所述的解脂耶氏酵母工程菌在食品、化工或制药领域的应用。
