本发明涉及一种催化合成udp/gdp-甘露糖的udp/gdp-葡萄糖差向异构酶，属于酶工程。
背景技术：
1、核苷酸糖供体在所有生命系统中起着重要的作用，作为单糖的活化形式可被糖基转移酶进一步利用，为低聚糖、多糖和糖缀合物的生物合成提供了活化的单糖。并应用于制药、化妆品和食品工业等多个领域中。常见的糖核苷酸，包括udp-glc,udp-glcnac,udp-glca,udp-gal,udp-galnac,udp-xyl,gdp-l-fuc,gdp-man和cmp-neu5ac。目前甘露糖的活化形式主要以gdp-甘露糖为主，也存在少部分udp-甘露糖，其中甘露糖供体gdp-man是蛋白质糖基化和糖基磷脂酰肌醇锚定合成所必需的关键代谢物，并且参与甘露寡糖、甘露聚糖以及甘露糖甘油酸的合成。此外甘露糖的稀有糖供体udp-man首次在mycobacteriumsmegmatis中发现。后续在小鼠组织器官中也鉴定出udp-man的存在，并且揭示了udp-man可能在特定哺乳动物器官(包括大脑)的糖基化中起独特作用。但目前获取核苷酸-甘露糖的反应复杂且成本较高。
2、差向异构化在碳水化合物合成中起到了至关重要的作用，可以通过颠倒糖不对称中心的立体结构，实现相互转化。碳水化合物差向异构酶是一类能够实现这种反应的酶。近年来，碳水化合物异构酶在稀有糖及其衍生物的生产中受到越来越多的关注。这些酶中的绝大多数只对活化后的核苷酸糖存在催化活性，可以催化游离糖的酶较少。作用于核苷酸糖底物的差向异构酶提供了更丰富的催化组合，包括氧化/还原和消除/重现，所以它们可以扩大底物异构转化的范围。
3、c2位核苷酸糖异构酶主要包括udp-乙酰氨基葡萄糖2-异构酶与cdp-泊雷糖2-异构酶。其中cdp-泊雷糖2-异构酶虽然催化核苷酸葡萄糖直接转化为核苷酸甘露糖，但是活性极低。提高cdp-泊雷糖2-异构酶的酶活有潜力实现核苷酸甘露糖的快速合成。开发热稳定性与酶活同时提高的cdp-泊雷糖2-异构酶将有利于实现核苷酸甘露糖的经济化、低成本的生产，进而降低核苷酸甘露糖的价格，为含有甘露糖基活性物质的合成提供了一个较为理想的供体底物原料。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是cdp-泊雷糖2-异构酶活力低的问题。
2、本发明提供了一种cdp-泊雷糖2-异构酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的cdp-泊雷糖2-异构酶的第144位的苏氨酸突变为异亮氨酸，第152位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，第157位的谷氨酰胺突变为脯氨酸，第203位的酪氨酸突变为脯氨酸，第227位的苏氨酸突变为组氨酸，第228位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第229位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第338位的异亮氨酸突变为色氨酸得到的，得到了t144i/y152f/q157p/y203p/t227h/i228v/s229f/i338w，命名为mut3；
3、或将氨基酸序列如seq id no.1所示的cdp-泊雷糖2-异构酶的第144位的苏氨酸突变为异亮氨酸，第152位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，第157位的谷氨酰胺突变为脯氨酸，第203位的酪氨酸突变为脯氨酸，第227位的苏氨酸突变为谷氨酸，第228位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第229位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第338位的异亮氨酸突变为色氨酸得到，得到了t144i/y152f/q157p/y203p/t227e/i228v/s229f/i338w，命名为mut4。
4、在本发明的一种实施方式中，所述cdp-泊雷糖2-异构酶的来源为：salmonellatyphi。
5、在本发明的一种实施方式中，编码所述cdp-泊雷糖2-异构酶的核苷酸序列如seqid no.2所示。
6、本发明还提供了编码上述cdp-泊雷糖2-异构酶突变体的基因。
7、本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
8、本发明还提供了表达上述cdp-泊雷糖2-异构酶突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。
9、在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
10、在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌为表达宿主。
11、本发明提供了一种提高cdp-泊雷糖2-异构酶热稳定性和/或酶活的方法，所述方法为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的cdp-泊雷糖2-异构酶的第144位的苏氨酸突变为异亮氨酸，第152位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，第157位的谷氨酰胺突变为脯氨酸，第203位的酪氨酸突变为脯氨酸，第227位的苏氨酸突变为组氨酸，第228位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第229位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第338位的异亮氨酸突变为色氨酸；
12、或将氨基酸序列如seq id no.1所示的cdp-泊雷糖2-异构酶的第144位的苏氨酸突变为异亮氨酸，第152位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，第157位的谷氨酰胺突变为脯氨酸，第203位的酪氨酸突变为脯氨酸，第227位的苏氨酸突变为谷氨酸，第228位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第229位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第338位的异亮氨酸突变为色氨酸。
13、本发明还提供了一种尿苷二磷酸甘露糖udp-man的制备方法，所述方法为，采用上述突变体或上述重组细胞或上述重组细胞表达的重组cdp-泊雷糖2-异构酶为催化剂，以尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glc)为底物，反应制备udp-man。
14、udp-man(c15h24n2o17p2)的结构式：
15、
16、尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glc，c15h24n2o17p2)的结构式：
17、
18、鸟苷二磷酸甘露糖(gdp-man，c16h25n5o16p2)的结构式：
19、
20、鸟苷二磷酸葡萄糖(gdp-glc，c16h25n5o16p2)的结构式：
21、
22、在本发明的一种实施方式中，所述突变体或重组cdp-泊雷糖2-异构酶的添加量为2.5-5g/l。
23、在本发明的一种实施方式中，反应条件为：在温度为30-60℃，底物浓度为10-50mm的条件下，反应4-6h。
24、在本发明的一种实施方式中，反应条件为：pb缓冲液(ph 8.0)，反应温度50℃，50mm底物反应4-6h。
25、本发明还提供了一种鸟苷二磷酸甘露糖gdp-man的制备方法，所述方法为，采用上述突变体或上述重组细胞或上述重组细胞表达的重组cdp-泊雷糖2-异构酶为催化剂，以鸟苷二磷酸葡萄糖gdp-glc为底物，反应制备gdp-man。
26、在本发明的一种实施方式中，所述突变体或重组cdp-泊雷糖2-异构酶的添加量为2.5-5g/l。
27、在本发明的一种实施方式中，反应条件为：在温度为30-60℃，底物浓度为10-50mm的条件下，反应4-6h。
28、在本发明的一种实施方式中，反应条件为：pb缓冲液(ph 8.0)，反应温度50℃，50mm底物反应4-6h。
29、本发明还提供了上述突变体或上述重组细胞或上述重组细胞表达的重组cdp-泊雷糖2-异构酶在制备尿苷二磷酸甘露糖udp-man或鸟苷二磷酸甘露糖gdp-man或含有尿苷二磷酸甘露糖udp-man的产品或含有鸟苷二磷酸甘露糖gdp-man的产品中的应用。
30、本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞，或上述制备方法在制备食品、保健品及化妆品中的应用。
31、有益效果
32、(1)本发明通过基因工程手段对salmonella typhi来源的cdp-泊雷糖2-异构酶(sttyve)进行改造，通过单点突变与组合突变得到热稳定性与酶活力提高的转化子，能在最适温度下实现udp/gdp-man的高效合成。
33、(2)mut3在50℃的半衰期为1.96h，是wt的58.51倍。以udp-glc为底物在40℃下的酶活比wt提高了73.21倍，比酶活为108.69mu/mg，对udp-glc的转化率达到了55.38％。对gdp-glc的转化率达到了23.84％。
34、(3)mut4在50℃的半衰期为2.02h，是wt的60.30倍。以udp-glc为底物在40℃下的酶活比wt提高了52.32倍，比酶活为77.44mu/mg，对udp-glc的转化率达到了55.63％。对gdp-glc的转化率达到了27.60％，其中wt对gdp-glc未检测出活性,对udp-glc的转化率仅有4.26％。
35、(4)应用突变酶可实现udp-man和gdp-man的高水平合成。在ph 8.0、反应温度50℃，50mm udp-glc的条件下，反应4-6h。mut3的udp-man最高产量为6.22g/l，gdp-man产量为1g/l；mut4的udp-man最高产量为11.03g/l，gdp-man产量为3g/l。wt在ph 8.0、反应温度50℃，50mm底物的条件下，反应4-6h，udp-man的最高产量仅达到0.17g/l，且无法催化合成gdp-man。
1.一种cdp-泊雷糖2-异构酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如seqid no.1所示的cdp-泊雷糖2-异构酶的第144位的苏氨酸突变为异亮氨酸，第152位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，第157位的谷氨酰胺突变为脯氨酸，第203位的酪氨酸突变为脯氨酸，第227位的苏氨酸突变为组氨酸，第228位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第229位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第338位的异亮氨酸突变为色氨酸得到的；
2.编码权利要求1所述cdp-泊雷糖2-异构酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组载体。
4.表达权利要求1所述的cdp-泊雷糖2-异构酶突变体，或携带权利要求2所述基因，或携带权利要求3所述重组载体的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
6.一种提高cdp-泊雷糖2-异构酶热稳定性和/或酶活的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的cdp-泊雷糖2-异构酶的第144位的苏氨酸突变为异亮氨酸，第152位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，第157位的谷氨酰胺突变为脯氨酸，第203位的酪氨酸突变为脯氨酸，第227位的苏氨酸突变为组氨酸，第228位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第229位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第338位的异亮氨酸突变为色氨酸；
7.一种尿苷二磷酸甘露糖udp-man或鸟苷二磷酸甘露糖gdp-man的制备方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1所述的突变体或权利要求4或5所述的重组细胞或权利要求4或5所述的重组细胞表达的重组cdp-泊雷糖2-异构酶为催化剂，以尿苷二磷酸葡萄糖udp-glc或鸟苷二磷酸葡萄糖gdp-glc为底物，反应制备udp-man或gdp-man。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述突变体或重组cdp-泊雷糖2-异构酶的添加量为：2.5-5g/l；优选的，反应条件为：在温度为30-60℃，底物浓度为10-50mm的条件下，反应4-6h。
9.权利要求1所述的突变体或权利要求4或5所述的重组细胞或权利要求4或5所述的重组细胞表达的重组cdp-泊雷糖2-异构酶在制备尿苷二磷酸甘露糖udp-man或鸟苷二磷酸甘露糖gdp-man或含有尿苷二磷酸甘露糖udp-man的产品或含有鸟苷二磷酸甘露糖gdp-man的产品中的应用。
10.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的重组载体，或权利要求4或5所述的重组细胞，或权利要求7或8所述的制备方法在制备食品、保健品及化妆品中的应用。
