本发明属于生物，具体涉及一种用于清除致病抗体的嵌合基因工程化纳米囊泡及其制备方法、应用。
背景技术：
1、作为免疫系统重要的组成部分，抗体对抵御外来致病微生物入侵、保护机体健康起着关键作用。但是，在某些情况下(自身免疫性疾病、器官移植等)抗体则对机体产生危害。在自身免疫性疾病中，由于免疫紊乱导致自身抗体识别并攻击机体自身的细胞、组织和器官，诱发免疫炎症反应和组织损伤。目前已知的自身免疫性疾病有100多种，常见的包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、炎症性肠病、重症肌无力、肺出血-肾炎综合征等。自身免疫性疾病在人群中并不少见，可引起相当高的致残率和致死率。在器官移植中，受者体内针对供体抗原特异性抗体可诱发抗体介导的排斥损伤反应，导致移植物功能障碍或移植物丢失。在自身免疫性疾病和器官移植治疗中，清除患者致病性抗体可以有效缓解症状，改善不良预后。
2、免疫吸附是利用具有高亲和力的吸附剂(抗原、抗体或具有物理化学亲和力的某些特定物质)固定于载体上制成免疫吸附柱，选择性或特异性地去除患者血液中致病性免疫复合物和抗体的体外治疗手段。与血浆置换相比，它相对选择性地清除致病抗体，具有不丢失白蛋白等血浆成分，不用额外补充新鲜血浆，避免血液传播性疾病等优势。目前临床上用于致病性抗体清除的常用免疫吸附柱是葡萄球菌蛋白a免疫吸附柱。其他免疫吸附柱还包括类蛋白a多肽、色氨酸或苯丙氨酸、抗igg多抗吸附剂等不同吸附剂的免疫吸附柱，在抗体吸附的强度和特异性各有各的特点。此外，新型的免疫吸附剂也在开发，例如cn107138139a公开了一种利用共价偶联的方式将小分子功能配基接枝于吸附载体材料上的免疫吸附剂。其活化方式为高密度活化，同时利用偶联间隔臂以实现小分子功能配基的柔性连接，可以提高功能配基稳定性、吸附容量和选择性。不过，抗体吸附的治疗方式仍存在一些缺陷，如需额外建立血管通路，治疗过程有过敏、出血等相关风险等。
3、细胞外囊泡是由细胞分泌的磷脂双分子层囊泡，可携带mrna、微小rna、细胞因子以及膜分子。细胞外囊泡具有生物相容性、生物可降解性、低毒性和非免疫原性等优点，可作为一种抗体吸附剂的有效递送载体。经过基因工程化改造，目的蛋白能够被包装入细胞外囊泡中，同时结合细胞外囊泡本身的靶向性等特性可用于疾病的高效治疗。目前，工程化纳米囊泡制备方法已在红细胞、巨噬细胞、血小板等研究领域得到应用。然而，自上而下策略制备的工程化纳米囊泡仍然一定存在局限性，如制备的颗粒大小尺寸不均匀、包封问题等。
4、因此，为了解决现有技术缺陷，有必要提出一种可以有效清除致病抗体的新型纳米囊泡制备方法。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种用于清除致病抗体的嵌合基因工程化纳米囊泡及其制备方法、应用的技术方案。
2、本发明具体采用以下技术方案实现：
3、本发明第一方面提供了一种嵌合基因工程化巨噬细胞的制备方法，其包括以下步骤：
4、s1：构建慢病毒载体，利用工程细胞包装慢病毒，得到含有蛋白a和蛋白g融合编码基因的慢病毒颗粒；
5、s2：用s1得到的病毒侵染巨噬细胞，通过培养筛选得到高纯度表达蛋白a和蛋白g融合基因的稳定细胞系。
6、进一步，所述s1中工程细胞为hek-293t细胞。
7、进一步，所述s1中所述蛋白a的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述蛋白b的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8、进一步，所述s2具体包括以下步骤：
9、将目的细胞巨噬细胞培养至密度为60-70％，加入s1得到的慢病毒颗粒，晃匀后放入培养箱培养48-72小时；
10、待细胞长到对数生长期进行二次感染；
11、加入嘌呤霉素2-4μg/ml筛选48-72小时；随后，降低嘌呤霉素维持浓度0.8-1.2μg/ml，继续对感染后的细胞进行24-48小时的筛选和扩增，从而获得高纯度表达特定基因的稳定细胞系。
12、本发明第二方面提供了利用上述方法制备得到的嵌合基因工程化巨噬细胞制备抗体吸附纳米囊泡的方法，其包括以下步骤：
13、1)采用乳化试剂挥发法制备plga纳米微球；
14、2)收集高纯度表达特定基因的稳定细胞，反复通过聚碳酸酯过滤器，离心洗涤获得细胞膜；
15、3)将步骤1)所述的plga纳米微球与步骤2)所述的细胞膜按比例混合均匀，依次通过400nm、200nm、100nm的聚碳酸酯膜，来回挤压，得到嵌合工程化膜包裹plga核心的纳米囊泡；
16、4)将步骤3)所述纳米囊泡与磷脂酰丝氨酸溶液混合进行表面修饰，获得抗体吸附用的纳米囊泡。
17、进一步，所述步骤1)具体为：
18、将含有plga的dcm溶液逐滴加入到2-4％w/v pva水溶液，超声处理形成水包油乳液；
19、将所得乳液在磁力搅拌器上室温下搅拌过夜；
20、在40-60℃下用旋转蒸发器蒸发溶液去除dcm溶剂残留物；
21、将乳液转移到离心管中，超速离心，离子水洗涤，将洗涤好的微球放入冻存管中真空冻干，保存于-20℃备用。
22、进一步，所述步骤2)中反复通过聚碳酸酯过滤器具体为：先通过10μm孔径的聚碳酸酯膜3-5次，再通过5μm孔径的膜3-5次；离心处理的参数为4℃，2000g，15-20分钟。
23、进一步，所述步骤3)中plga纳米微球与细胞膜按质量比10-20:1比例混合。
24、进一步，所述步骤4)中磷脂酰丝氨酸溶液浓度为10％-15％。
25、本发明第三方面提供了利用上述制备方法得到的抗体吸附纳米囊泡。
26、本发明第四方面提供了上述的抗体吸附纳米囊泡在制备药物中的应用，所述药物的用途为如下(a1)-(a6)中的任一种：
27、(a1)吸附清除抗体；
28、(a2)阻断补体系统激活；
29、(a3)减轻炎症聚集并保护移植肾微血管内皮；
30、(a4)抑制次级淋巴组织内b细胞的增殖与活化；
31、(a5)缓解同种异体反应性抗体介导的移植肾损伤；
32、(a6)改善移植肾功能和肾移植受者长期预后。
33、本发明的有益效果具体为：
34、1.构建了嵌合基因工程化稳定细胞系，兼顾吸附igg各亚型；
35、本发明所述提供的一种嵌合基因工程化巨噬细胞的制备方法，通过慢病毒颗粒转染，构建蛋白a/g基因的稳转细胞系，从而能够稳定表达蛋白a与蛋白g。融合蛋白a/g可以弥补单纯蛋白a与igg3结合能力弱的缺点，提高抗体igg的吸附效果。
36、2.构建的纳米囊泡稳定，大小均一，保证完整性；
37、通过采用粒径相对均一的plga纳米颗粒作为目标囊泡的核心，同时与挤压断裂的工程化细胞膜相混合，促进细胞膜自组装，形成细胞外囊泡模拟物，从而提高目标纳米囊泡的稳定性。
38、3.纳米囊泡可以做到体内吸附和清除抗体，减少有创操作和出血风险；
39、本发明所述制备及分离纳米囊泡，可应用于体内吸附和清除抗体，生物安全性好，避免了目前免疫吸附柱使用过程中透析置管操作风险和治疗过程中的出血、过敏等风险。
40、4.纳米囊泡被巨噬细胞吞噬后可发挥免疫调节作用，减少免疫抑制剂使用。
41、本发明所述制备及分离纳米囊泡的方法，可以诱导巨噬细胞的吞噬，促进抗原抗体的有效降解清除，同时可使巨噬细胞吞噬后表现出免疫抑制功能上调，有助于提高治疗器官移植抗体介导排斥反应的效果。
1.一种嵌合基因工程化巨噬细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种嵌合基因工程化巨噬细胞的制备方法，其特征在于所述s1中所述蛋白a的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述蛋白b的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3.如权利要求1所述的一种嵌合基因工程化巨噬细胞的制备方法，其特征在于所述s2具体包括以下步骤：
4.利用权利要求1-3任一所述的制备得到的嵌合基因工程化巨噬细胞制备抗体吸附纳米囊泡的方法，其特征在于包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)具体为：
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述步骤2)中反复通过聚碳酸酯过滤器具体为：先通过10μm孔径的聚碳酸酯膜3-5次，再通过5μm孔径的膜3-5次；离心处理的参数为4℃，2000g，15-20分钟。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中plga纳米微球与细胞膜按质量比10-20：1比例混合。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)中磷脂酰丝氨酸溶液浓度为10％-15％。
9.利用权利要求4-8制备方法得到的抗体吸附纳米囊泡。
10.如权利要求9所述的抗体吸附纳米囊泡在制备药物中的应用，所述药物的用途为如下(a1)-(a6)中的任一种：
