本技术涉及活化蛋白c(apc)的抗体、抗体片段和其他结合物以及相关制剂、核酸、制备方法和使用方法。
背景技术：
1、蛋白c(pc)是一种酶原，在肝中作为单链的461个氨基酸前体(seq id no:633)合成并分泌到血液中。在分泌之前，通过去除赖氨酸-精氨酸二肽(seq id no:633中的氨基酸198-199)和42个氨基酸的前原前导序列(seq id no:633中的氨基酸1-42)，将单链前体转化为异二聚体。异二聚体形式(417个氨基酸)由通过二硫桥连接的轻链(155个氨基酸，21kda)和重链(262个氨基酸，41kda)组成。轻链包含一个γ-羧基谷氨酸(gla)结构域(45个氨基酸)、两个egf样结构域(46个氨基酸)和接头序列，而重链包含高极性活化肽(seq idno:633中的氨基酸200-211)和具有典型丝氨酸蛋白酶催化三联体的催化结构域。pc酶原在凝血酶切割位点处的切割导致去除活化肽并且将pc活化为活化pc(apc；seq id no:634；405个氨基酸)。
2、人pc经历大量的翻译后修饰，包括糖基化、维生素k依赖性γ-羧化和γ-羟基化。它包含四个潜在的n连接糖基化位点：一个位于轻链(asn97)，三个位于重链(asn248、asn313和asn329)。其gla结构域包含九个gla残基，负责pc与带负电荷的磷脂膜的钙依赖性结合。gla结构域还可以与内皮蛋白c受体(epcr)结合，在pc活化期间在内皮膜上对齐凝血酶和血栓调节蛋白。
3、pc活化发生在内皮细胞表面上，分两步过程。它需要pc(经由gla结构域)与内皮细胞上的epcr结合，随后通过凝血酶/血栓调节蛋白复合物在重链arg12处对pc进行蛋白水解切割。这种单一切割释放12个氨基酸的活化肽，将酶原pc转化为活性丝氨酸蛋白酶apc。
4、在生理条件下，apc在人血液中以非常低的浓度(1-2ng/ml或40pm)循环，半衰期为20-30分钟，而pc以高得多的浓度(3-5μg/ml或65nm)循环，半衰期为6-8小时。
5、pc途径在调节凝血中发挥着关键作用，并且通过在凝血反应增强时放大抗凝血反应，用作针对血栓形成的天然防御机制。受伤后，生成凝血酶以启动凝血。凝血酶还通过与血管表面内壁的血栓调节蛋白结合来触发抗凝血反应，从而促进pc活化。因此，apc生成与凝血酶浓度和pc水平相关。apc通过经由蛋白水解切割使两种凝血辅因子(即，因子va和因子viiia)失活而发挥抗凝血剂的作用，从而抑制凝血酶生成。apc还通过与纤溶酶原活化剂抑制剂形成复合物，直接有助于纤维蛋白溶解反应的增强。
6、在医疗状况和与医疗程序相关的情况下，出血都是一个主要问题。例如，出血导致外科手术、器官移植、颅内出血、主动脉瘤、产后出血、创伤和某些抗凝血剂过量用药后的并发症。事实上，1-44岁的人死亡的主要原因是与创伤相关的急性出血。目前治疗致命的不可压迫性出血的选择很少。出血性疾病(bleeding disorder)可以通过抑制apc促进凝血酶生成和凝血来治疗。因此，本发明的第一目的是提供一种安全且有效的出血治疗。
7、除其抗凝血功能之外，apc还通过其抗细胞凋亡、抗炎和内皮屏障稳定活性来诱导细胞保护作用，所有这些功能都有助于与apc相关的再生结果(例如，刺激神经发生、血管生成和伤口治愈)。
8、缺血是一种致命的病症，这是由于器官或组织供血不足。供血不足导致组织缺氧，并且可潜在地导致心脏病发作或中风。在代谢高度活跃的组织(诸如心脏和脑)中，缺血可能在短短3-4分钟内引起不可逆的损伤。apc的细胞保护作用包括减少细胞凋亡和抑制缺血后炎症介质的表达。因此，本发明的第二目的是提供一种安全且有效的缺血治疗。
9、对人疾病和动物模型的研究表明，细胞外组蛋白参与多种器官的炎症过程的发生或发展(moiana等人,clin biochemistry 94(2021年)12-19在15)。因此，组蛋白正在被研究作为其中炎症和血栓形成发挥关键病理生理作用的疾病的潜在治疗靶标。apc通过组蛋白蛋白水解降低细胞外组蛋白的细胞毒性。apc的这种功能依赖于带负电荷的外位点，包括glu330和glu333。
10、已知细胞外组蛋白是脓毒病死亡的主要介质。脓毒病是一种致命的病症，当身体对感染的反应导致其自身组织和器官损伤时就会发生该病症。在美国，脓毒病是发病率和死亡率的主要原因，每年导致近270,000人死亡。apc的细胞保护作用包括抑制与脓毒病死亡相关的组蛋白毒性。因此，本发明的第三目的是提供一种安全且有效的脓毒病治疗。
11、组蛋白构成中性粒细胞胞外陷阱(net)的一部分，细胞外纤维网络，主要由中性粒细胞的dna组成。net已被证明参与癌症的发病机制和进展。癌症是全世界的主要死亡原因，在2020年导致近10百万人死亡或六分之一的死亡。net通过数种机制影响癌症，包括炎症微环境的建立以及与其他促肿瘤机制(诸如炎性小体和自噬)的相互作用(shao等人,frontiers in oncology第11卷第714357期(2021年)第1页)。证据表明，net在多种癌症类型中发挥作用，包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、血液癌、神经癌和皮肤癌(同上，第6页)。因此，影响pc途径的干预可以潜在地影响癌症，并且本发明的第四目的是提供一种安全且有效的癌症治疗。
12、基于apc的治疗剂已经开发了数年。apc的基因工程已经产生了选择性降低其抗凝血或细胞保护活性的apc变体。(griffin等人,blood 125:2898,2015年)。例如，一种这种变体3k3a-apc(lys191-193ala)具有小于10％的野生型apc的抗凝血活性，同时保留其完整的细胞保护活性，并且已进入缺血性中风的临床试验。然而，先前将研究观察结果转变为基于apc的药物的尝试都已经失败，包括最初尝试使用apc治疗脓毒病。虽然在2001年，令人鼓舞的临床试验结果导致基于重组apc蛋白的药物(drotrecogin alfa(活化)、重组人活化蛋白c(rhapc)，商品名xigristm)获得批准(nengl j med 344:699,2001年)，但是最初的积极结果并未在后续的随机临床试验中得到重复，该药物已从市场上撤回。
13、使用外源性蛋白质(诸如apc和apc变体)作为治疗剂的一个潜在问题是受体的免疫系统生成针对它们的抗药物抗体(ada)的可能性。ada的产生可能产生严重后果，诸如药物功效丧失和中和或其他不良事件(j pharm sci110(7):2575-2584,2021)。因此，本发明的第五目的是提供一种具有较低免疫原性风险的基于apc的治疗剂。
14、apc的抗体已被探索作为选择性增强或抑制apc不同功能的手段(参见，例如，zhao等人，美国专利申请公开20150307625，2015年10月29日公开和egner等人，美国专利申请公开2018326053，2018年11月15日公开)。例如，magisetty等人报道了选择性抑制apc的抗凝血活性同时保留其细胞保护活性的鼠抗体显著降低血友病性关节病小鼠模型的关节出血的严重程度，而抑制apc的抗凝血和细胞保护活性的抗体则不会(blood(2022年)blood.2021013119)。在zhao等人中，apc的两种不同抗体被评估为基于apc的血友病治疗(nat commun 11(1):2992,2020年)。一种抗体被称为i类，靶向apc的活性位点，而另一种抗体被称为ii类，靶向apc的外位点。当向猴子施用这些抗体时，凝血酶生成增加并且促进血浆凝固。然而，尽管ii类抗体耐受性良好，但是i类抗体导致动物死亡。然而，ii类抗体仍然部分抑制apc的活性位点，这表明它可能部分抑制apc的细胞保护作用。因此，本发明的第六目的是提供一种维持或增强apc的细胞保护作用的抗apc抗体。
技术实现思路
1、在第一方面，本发明提供了分离的抗体，其与活化蛋白c(apc)特异性结合并且与非活化蛋白c(pc)最低程度地结合。在一些实施方案中，抗体包含cdr3，该cdr3包含选自由seq id no:317-474组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含选自由seq idno:475-632组成的组的重链可变结构域(vh)。
2、在第二方面，本发明提供了编码本文所公开的抗体的核酸。
3、在第三方面，本发明提供了包含本文所公开的核酸的载体。
4、在第四方面，本发明提供了包含本文所公开的核酸或载体的宿主细胞。
5、在第五方面，本发明提供了产生本文所公开的抗体的方法。所述方法包括：(a)在导致抗体产生的条件下培养本文所公开的宿主细胞；以及(b)从宿主细胞中分离抗体。
6、在第六方面，本发明提供了包含本文所公开的抗体以及药学上可接受的载剂的药物组合物。
7、在第七方面，本发明提供了治疗或预防受试者的病症的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所公开的抗体、本文所公开的与外源性apc蛋白或其变体特异性结合的抗体、或本文所公开的药物组合物。在一些实施方案中，病症是可以通过增强或抑制apc的抗凝血功能治疗或预防的病症。在其他实施方案中，病症是可以通过增强或抑制apc的细胞保护功能治疗或预防的病症。
8、在第八方面，本发明提供了本文所公开的抗体作为药物的用途。
1.一种分离的抗体，其包含cdr3，所述cdr3包含选自由seq id no:317-474组成的组的氨基酸序列，其中所述抗体与活化蛋白c(apc)特异性结合并且与非活化蛋白c(pc)最低程度地结合。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体进一步包含(a)cdr1，其包含选自由seq idno:1-158组成的组的氨基酸序列，(b)cdr2，其包含选自由seq id no:159-316组成的组的氨基酸序列，或者(c)cdr1和cdr2，所述cdr1包含选自由seq id no:1-158组成的组的氨基酸序列，所述cdr2包含选自由seq id no:159-316组成的组的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的抗体，其中所述抗体包含具有选自由seq id no:475-632组成的组的氨基酸序列的重链可变区(vh)的cdr1、cdr2和cdr3。
4.如权利要求3所述的抗体，其中所述抗体包含：
5.一种分离的抗体，其包含vh，所述vh包含选自由seq id no:475-632组成的组的氨基酸序列，其中所述抗体与apc特异性结合并且与pc最低程度地结合。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中所述抗体与apc的外位点结合。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗体，其中所述抗体是选自由igg1抗体、igg2抗体、igg3抗体、igg4抗体、igm抗体、iga1抗体、iga2抗体、分泌型iga抗体、igd抗体、ige抗体及其抗原结合片段组成的组的抗体。
8.如权利要求1-6中任一项所述的抗体，其中所述抗体是纳米抗体。
9.如权利要求8所述的抗体，其中所述抗体是vhh抗体。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗体，其中所述抗体：
11.一种分离的抗体，其与apc特异性结合，与pc最低程度地结合，并且与如权利要求1所述的抗体竞争与apc的结合。
12.一种核酸，其编码如权利要求1-11中任一项所述的抗体。
13.一种载体，其包含如权利要求12所述的核酸。
14.一种宿主细胞，其包含如权利要求12所述的核酸或如权利要求13所述的载体。
15.一种产生抗体的方法，所述方法包括：
16.一种药物组合物，其包含如权利要求1-11中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载剂。
17.一种治疗或预防受试者的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-11中任一项所述的抗体、如权利要求1-11中任一项所述的与外源性apc蛋白或其变体特异性结合的抗体、或如权利要求16所述的药物组合物。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述病症是可以通过增强或抑制apc的抗凝血功能治疗或预防的病症。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述病症选自由以下各项组成的组：出血、挫伤、烧伤、胃肠出血、未受控制的出血、由移植或切除手术引起的出血、由外科手术引起的出血、由创伤引起的出血、静脉曲张出血、肝硬化出血、血小板减少、特发性血小板减少性紫癜、血友病、主动脉瘤、抗凝血剂或抗血栓形成剂的过量施用、月经过多、凝血因子缺乏、格兰茨曼血小板功能不全和贝尔纳-苏利耶综合征。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述病症是可以通过增强或抑制apc的一种或多种细胞保护功能治疗或预防的病症。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述病症选自由以下各项组成的组：
22.如权利要求1-11中任一项所述的抗体，其用作用于治疗或预防病症的药物。
23.如权利要求22所述的抗体，其中所述病症是可以通过增强或抑制apc的抗凝血功能治疗或预防的病症。
24.如权利要求23所述的抗体，其中所述病症选自由以下各项组成的组：出血、挫伤、烧伤、胃肠出血、未受控制的出血、由移植或切除手术引起的出血、由外科手术引起的出血、由创伤引起的出血、静脉曲张出血、肝硬化出血、血小板减少、特发性血小板减少性紫癜、血友病、主动脉瘤、抗凝血剂或抗血栓形成剂的过量施用、月经过多、凝血因子缺乏、格兰茨曼血小板功能不全和贝尔纳-苏利耶综合征。
25.如权利要求22所述的抗体，其中所述病症是可以通过增强或抑制apc的一种或多种细胞保护功能治疗或预防的病症。
26.如权利要求25所述的抗体，其中所述病症选自由以下各项组成的组：
