本发明涉及一种将外源dna序列整合到细胞的基因组中的方法，包括使细胞与供体核酸、与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和识别靶向序列的核酸酶接触。本发明还涉及包含所述供体核酸和/或与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和/或核酸酶的构建体、载体、系统和药物组合物及其医学用途。
背景技术：
0、发明背景
1、在过去几年中，基因组编辑已成为用于治疗遗传性疾病的可行选项。基因组编辑使用核酸内切酶，通常是crispr/cas9[1,2]。crispr-cas9是一种核糖核蛋白，结合被称为引导rna(grna)的序列，并使用它通过watson-crick碱基互补性识别靶dna序列。该靶dna序列必须与前间区邻近基序(pam)序列相邻，这允许cas9与dna结合并裂解靶序列[3]。cas9的基于rna的靶向有利于其靶向不同基因座的设计，并且甚至允许通过将cas9和2种不同的grna递送至同一细胞来靶向2种不同的序列。cas9被靶向至基因组中的特定位置后，它会产生双链断裂(dsb)，这将通过两种修复机制之一进行修复：
2、非同源末端连接(nhej)是大多数细胞类型中最主要的机制，因为该机制在细胞周期的所有阶段都是活性的，并且由dsb的位点中随机碱基的插入或缺失组成以修复dsb。这种随机插入或缺失(indel)通常会导致阅读框的改变，从而敲除被靶向的基因的表达[3]。
3、同源定向修复(hdr)是主要发生在细胞周期的g和s2期并且使用同源模板的过程，该模板可以由外部供体dna或由其他等位基因提供，用于dsb的精确校正[3]。通过hdr的基因校正已经在体外[4]和体内[5-8]成功使用，即使在不存在cas9的情况下也成功使用[6]。然而，其在体内的效率受到分化细胞中同源重组途径的低活性的限制[9]。因此，在本领域中对于能够在未经历主动再生的组织和分化细胞中进行基因校正的替代治疗性基因置换策略存在需求。
4、最近开发了同源性非依赖性靶向整合(homology-independent targetedintegration，hiti)[10,11]，以克服等位基因特异性敲除和hdr基因校正两者的局限性。hiti使用侧翼为感兴趣的基因内相同grna靶序列的供体dna。在cas9裂解基因和供体dna两者之后，细胞的nhej机制可以在裂解的修复中包括供体dna，在不存在插入/缺失的情况下具有令人惊讶的高(60％-80％)整合率。供体dna可能的反向整合通过将其grna靶序列反向来避免，使得如果发生反向整合，cas9可以识别并再次切割靶序列。因为hiti使用nhej，所以它在终末分化的细胞(如神经元)或组织(如肝脏)中有效，独立于其再生潜力(例如在成人和儿童组织两者中)[11]。此外，hiti介导的治疗基因的野生型拷贝的插入具有独立于特定致病突变和靶细胞的潜在增殖状态的治疗潜力[11]。
5、本发明人先前已经发现，hiti可以用于在工厂中转化肝脏以全身性释放高水平的治疗性蛋白质，这对于由功能丧失引起的许多遗传性和常见状况的治疗，或者其中待替换的因子从肝脏分泌和/或必须通过血液到达其他靶器官以执行其功能的状况的治疗是期望的，如在血友病、lsd或糖尿病中，克服了当前可用疗法如低效酶替代疗法、传统基因疗法和基因编辑的局限性。
6、基于腺相关病毒(aav)的载体是基因治疗的体内应用最常使用的，因为它们具有安全性谱、广泛的趋向性和提供长期转基因表达的能力[12]。然而，考虑到aav基因组的附加体状态(episomal status)，来自aav的肝转基因表达可能会随着时间在发育中的肝脏中丢失，或者因存在肝损伤而丢失[13]，导致成功有限，例如在儿科患者中。
7、因此，对更稳定和有效的肝转基因表达存在需求。
8、本发明人开发的hiti通过在高度转录的白蛋白基因座中插入感兴趣的分泌蛋白的编码序列克服了所述限制[5-8]，提供高水平的全身性分泌蛋白的长期表达，同时保留白蛋白的内源性表达。
9、黏多糖贮积症vi型(mps vi)是罕见的溶酶体贮积病(lsd)，由芳基硫酸酯酶b(arsb)缺乏引起，导致毒性糖胺聚糖(gag)的广泛积累和尿排泄。临床上，mps vi表型的特征是生长迟缓、面部特征粗糙、骨骼畸形、关节僵硬、角膜混浊、心脏瓣膜增厚和器官肥大，无原发性认知障碍[14]。mps的治疗依赖于分泌的正常溶酶体水解酶，并且然后经由甘露糖-6-磷酸受体途径被大多数细胞摄取。
10、本发明人先前证明，单次全身施用重组aav载体血清型8(aav2/8)，其在肝脏特异性甲状腺素结合球蛋白(tbg)启动子的转录控制下编码arsb(aav2/8.tbg.harsb)，导致mpsvi动物模型中的持续肝脏转导和表型改善[15-21]。本发明人还示出了，这在mps vi小鼠中至少与每周施用酶替代疗法(ert)一样有效，ert是该状况的当前护理标准[22-24]。本发明人最近启动了i/ii期临床试验(clinicaltrials.gov identifier:nct03173521)，以测试该方法在mps vi患者中的安全性和有效性两者。
11、血友病a (hema)是由凝血因子viii或8(fviii或f8)的活性缺乏或完全缺失引起的严重出血性紊乱。它是最常见的遗传性x连锁隐性凝血障碍，在全球范围内发病率约为1/5,000名男性活婴。
12、约50％的hema的病例是严重的，即具有小于1％的循环fviii水平[25]。严重形式的hema临床表现为自发性肌肉骨骼和软组织出血，以及除非输注浓缩的凝血因子，否则创伤后无法止血。目前的治疗是预防性施用重组或血浆衍生的凝血fviii。经常需要输注(每周两次或三次)，并且可能会很麻烦。此外，它们不能预防自发性出血，并且总是存在产生中和性抗fviii抗体(抑制剂)的高风险(在约25％-30％的患者中)。因此，基因疗法作为替代疗法有望实现单次施用终身治愈。
13、在过去的20年里，人们对hema基因治疗的应用进行了广泛的研究，发现即使是fviii水平的适度改善(1％-2％)也能显著降低自发性出血事件的风险，并减少fviii替代输注的需要。此外，基因治疗具有广泛的治疗范围，其中基因表达不需要严格调节，并且具有易于量化的治疗终点(fviii血浆水平)。已经对几种用于fviii替代的基因转移策略进行了评价，并且腺相关病毒(aav)载体正成为最有前途的载体，因为该载体具有出色的安全性谱和指导有丝分裂后组织(诸如肝脏)长期转基因表达的能力。然而，hema给aav基因治疗带来了很大的挑战，因为要转移的f8基因编码序列的大小(7kb)超过了标准的aav的4.7kb的运载能力。此前，包含b结构域缺失(bdd)f8以及短肝脏特异性启动子和多腺苷酸信号两者的5kb的表达盒已被包装到aav5中，并在小鼠和食蟹猴[26]以及hema患者中显示出导致治疗水平的fviii[27]。然而，该载体的基因组略大，并且被包装在aav衣壳中作为异质截短基因组(heterogeneous truncated genomes)文库，在靶细胞中重组后导致转导无效。与正常大小的aav载体相比，超大的aav载体的效率较低，并且这种具有异质截短基因组的产品的质量可能会阻碍其进一步发展。所有在临床研究中的基于aav的产品都由大小为～4.4kb的f8转基因的b结构域缺失(bdd)版本组成[28]。然而，如此大的转基因在载体中为所需的调节元件留下了有限的空间，从而限制了启动子和多腺苷酸信号的选择。此外，所有这些载体基因组都处于aav的正常运载能力的边缘，并且存在被不当包装为异质截短基因组的文库的风险。尽管这种超大载体能够成功表达大蛋白质，但它们的长期效率和安全性仍有待证实[28-32]。
14、在肝细胞中在高度转录的白蛋白基因座处的hiti有可能克服用aav的其他安全并有效的肝脏基因疗法的若干限制，包括：i.其从白蛋白基因座的转基因表达水平特别高；ii.通过在基因组基因座处插入治疗性编码序列来保证转基因表达的稳定性，即使发生肝细胞的细胞损失以及在发育中的肝脏中，所述基因座也将被复制，从而使儿科患者可以使用该疗法。
15、在wo2020079033中公开了基于hiti将外源dna序列整合到细胞的基因组中的先前方法，其中特别地靶向白蛋白基因的第二外显子。在该方法中，通过插入携带感兴趣的转基因的供体dna破坏靶向的白蛋白基因座。
16、对用于需要治疗性蛋白质的稳定全身表达的疾病的基因治疗策略仍然存在需求。
技术实现思路
0、发明概述
1、发明人现在已经发现了一种用于利用靶向白蛋白基因的hiti系统将外源dna序列整合到细胞的基因组中而不破坏其表达的新方法。已经在mps vi小鼠中用编码芳基硫酸酯酶b(黏多糖贮积症vi(mps vi)中缺乏的溶酶体酶)的arsb和在血友病小鼠中用编码血友病a中缺失的因子viii的f8 codopv3转基因提供了功效证据。
2、本发明人现在发现，通过新型hiti系统在小鼠白蛋白(malb)的3’末端处整合转基因(诸如arsb或f8)导致丢失的酶的水平和/或活性增加。特别地，arsb的整合在两个测试剂量导致循环超生理水平的酶，而一个剂量诱导较低水平的循环酶，以及在mps vi小鼠中新生小鼠递送后长达36周的表型改善，而与未受影响的对照相比，用本发明的系统治疗的血友病小鼠中的f8活性水平增加20％。发明人还证明了在体外将报告基因整合到人类白蛋白(halb)的3’末端。
3、总体而言，新型hiti导致随着肝细胞增殖治疗性转基因从肝脏的稳定、高表达水平。
4、本发明依赖于在肝脏中高水平表达的基因(即白蛋白)的基因座内插入感兴趣的序列。尽管来自肝脏实质内相对少量的细胞，感兴趣的基因在白蛋白启动子下表达，导致感兴趣的基因的高水平表达，因此感兴趣的基因的表达足够高以实现治疗效果。此外，由于感兴趣的基因稳定地整合在肝脏基因组中，因此在组织再生时(在儿童中或在肝脏损伤时)，感兴趣的基因的表达不会丢失。白蛋白基因座用允许保存白蛋白基因的表达的策略靶向。
5、本发明的一个目的是将外源dna序列整合到细胞的基因组中的方法，所述方法包括使所述细胞与以下接触：
6、a)供体核酸，包含：
7、-所述外源dna序列
8、-任选地一个或更多个白蛋白外显子
9、其中所述供体核酸在5’和3’侧接反向靶向序列；
10、b)与靶向序列同源的互补链寡核苷酸，和
11、c)识别所述靶向序列的核酸酶，
12、其中所述靶向序列位于白蛋白基因的3’末端的选自所述白蛋白基因的内含子9、内含子11、内含子12、内含子13和内含子14的区域中。
13、在本发明中，供体核酸优选地包含一个或更多个白蛋白外显子，并且所述外显子是外显子10和/或外显子11和/或外显子12和/或外显子13和/或外显子14或其片段。
14、本发明的另一个目的是将外源dna序列整合到细胞的基因组中的方法，所述方法包括使细胞与以下接触：
15、a)供体核酸，包含：
16、-所述外源dna序列
17、-任选地一个或更多个白蛋白外显子
18、其中所述供体核酸在5’和3’侧接反向靶向序列；
19、b)与靶向序列同源的互补链寡核苷酸，和
20、c)识别所述靶向序列的核酸酶，
21、其中所述靶向序列位于白蛋白基因的3’末端的选自所述白蛋白基因的内含子12、内含子13和内含子14的区域中。
22、在本发明中，供体核酸优选地包含一个或更多个白蛋白外显子，并且所述外显子是外显子13和/或外显子14或其片段。
23、在一种优选的实施方案中，存在所述白蛋白外显子，并且它是(它们是)外显子10和/或外显子11和/或外显子12和/或外显子13和/或外显子14或其片段。优选地，它位于外源dna序列的5’末端，可以通过核糖体跳跃序列与外源dna序列隔开。
24、在一种优选的实施方案中，存在所述白蛋白外显子，并且它是外显子13和/或外显子14或其片段。优选地，它位于外源dna序列的5’末端，可以通过核糖体跳跃序列与外源dna序列隔开。在本发明中，供体核酸优选地包含一个或更多个白蛋白外显子，并且所述外显子是外显子10和/或外显子11和/或外显子12和/或外显子13和/或外显子14或其片段。
25、在本发明中，供体核酸优选地包含一个或更多个白蛋白外显子，并且所述外显子是外显子13和/或外显子14或其片段。
26、所述白蛋白外显子可以来自任何来源的白蛋白基因，优选地它们来自人类或鼠白蛋白基因。
27、优选地，与靶向序列同源的互补链寡核苷酸是与位于白蛋白基因的内含子9、内含子11、内含子12、内含子13或内含子14内的靶向序列或其互补链杂交的引导rna，优选地所述引导rna与前间区邻近基序(pam)序列相邻。
28、优选地，与靶向序列同源的互补链寡核苷酸是与位于白蛋白基因的内含子12、内含子13或内含子14内的靶向序列或其互补链杂交的引导rna，优选地所述引导rna与前间区邻近基序(pam)序列相邻。
29、优选地，靶向序列是引导rna(grna)靶位点，并且与靶向序列同源的所述互补链寡核苷酸是引导rna，该引导rna与位于内含子12、内含子13或内含子14内的靶向序列或其互补链杂交。因此，所述寡核苷酸引导核酸酶在白蛋白基因的内含子12、13或14内切割。优选地，所述引导rna与前间区邻近基序(pam)序列相邻。
30、优选地，靶向序列是引导rna(grna)靶位点，并且与靶向序列同源的所述互补链寡核苷酸是引导rna，该引导rna与位于内含子9、内含子11、内含子12、内含子13或内含子14内的靶向序列或其互补链杂交。因此，所述寡核苷酸引导核酸酶在白蛋白基因的内含子9、内含子11、内含子12、内含子13或内含子14内切割。优选地，所述引导rna与前间区邻近基序(pam)序列相邻。
31、在本发明的上下文中，白蛋白基因优选地为人类基因或鼠基因。
32、优选地，所述靶向序列包含seq id no:1-2、9-18、54、92-98中的任一个的序列或其片段或基本上具有与seq id no:1-2、9-18、54、92-98中的任一个或其片段具有至少95％同一性的序列，和/或与靶向序列同源的互补链寡核苷酸包含seq id no:1-2、9-18、54、92-98中的任一个的序列或其片段或基本上具有与seq id no:1-2、9-18、54、92-98中的任一个或其片段具有至少95％同一性的序列。
33、在该实施方案中，包含seq id no:2、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:54、92-98或其片段或与seqid no:2、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:17、seqid no:18、seq id no:54、92-98或其片段具有至少95％同一性的引导rna可以与包含seqid no:1、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:16、seqid no:17或seq id no:18或其片段或与seq id no:1、seq id no:9、seq id no:11、seq idno:13、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17或seq id no:18或其片段具有至少95％同一性的靶序列结合，或与这些序列的互补链结合。
34、在该实施方案中，包含seq id no:2、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:17或18或其片段或与seq id no:2、seq id no:10、seq idno:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:17或18或其片段具有至少95％同一性的引导rna可以与包含seq id no:1、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13或seq idno:15、seq id no:16、seq id no:17或18或其片段或与seq id no:1、seq id no:9、seq idno:11、seq id no:13或seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17或18或其片段具有至少95％同一性的靶序列结合，或与这些序列的互补链结合。
35、优选地，所述片段长为至少15个核苷酸。
36、在一种实施方案中，靶向序列和相应的grna如表1和表3中所描述。
37、本发明还包括其中上述序列，即seq id no:1、2、9-18、54、92-98具有反向取向，即从3’到5’的实施方案。
38、本发明还包括其中上述序列，即seq id no:1、2、9-18、54、92-98是rna的实施方案。
39、所述grna也是本发明的目的。
40、本发明的另外的目的是分离的引导核糖核酸(grna)，其包含以下或由以下组成：与选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq idno:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17或seq id no:18、54、92-98的序列及其至少15个核苷酸长的部分基本上互补或完全退火的序列。
41、优选地，白蛋白基因来自人类或小鼠。
42、所述白蛋白基因内含子可以在任何来源的白蛋白基因中，优选地它们在人类或鼠白蛋白基因中。
43、在一种实施方案中，与靶向序列同源的互补链寡核苷酸受启动子，优选地受u6启动子的控制。
44、在本发明中，引导rna或grna可以用作与靶向序列同源的互补链寡核苷酸的同义词。
45、在一种优选的实施方案中，所述外源dna序列是芳基硫酸酯酶b(arsb)基因的编码序列。优选地，所述arsb编码序列是人类的。优选地，它包含seq id no:33的序列或基本上具有与seq id no:33具有至少95％同一性的序列。编码序列可以编码芳基硫酸酯酶b(arsb)的变体，例如它可以包含相对于野生型芳基硫酸酯酶b(arsb)基因的编码序列的添加、缺失或取代，只要这些蛋白质变体保留与原始arsb基本上相同的相关功能活性。编码序列还可以编码芳基硫酸酯酶b(arsb)的片段，只要该片段保留与原始arsb基本上相同的相关功能活性。
46、合适地，编码序列可以被密码子优化以在人类中表达。
47、在另外的优选的实施方案中，所述外源dna序列是因子8(f8)基因或b结构域缺失(bdd)f8基因的编码序列。优选地，所述bdd f8编码序列是人类的，更优选地，其包含seq idno:36或55的序列或基本上具有与seq id no:36或55具有至少95％同一性的序列。优选地，f8编码序列包含seq id no:36或55的序列或基本上具有与seq id no:36或55具有至少95％同一性的序列。编码序列可以编码bdd f8或f8的变体，例如它可以包含相对于野生型bdd f8基因或野生型f8基因的编码序列的添加、缺失或取代，只要这些蛋白质变体保留分别与原始bdd f8或f8基本上相同的相关功能活性。编码序列也可以编码bdd f8或f8的片段，只要该片段保留分别与原始bdd f8或f8基本上相同的相关功能活性。
48、在另外的优选的实施方案中，所述外源dna序列是在隐性遗传性疾病患者中引起功能丧失的突变有关的基因的编码序列。因此，肝脏可以用作治疗靶。
49、在另外的优选的实施方案中，所述外源dna序列是在α1-抗胰蛋白酶(aat)缺乏症、wilson病、oat缺乏症、mpsvii中突变的一种或更多种f9基因的编码序列。
50、在本发明的上下文中，反向靶向序列一个位于供体核酸的上游，并且一个位于下游，供体核酸是被切割并且然后整合到靶向基因座中的dna构建体。反向靶向序列是识别靶基因组基因座中的引导rna的完全相同的序列，即靶向序列，但其相对于基因组序列是反向的或逆向的。反向或逆向意指如果靶向序列具有特定的5’-3’序列，则反向靶向序列具有相同的序列但具有3’-5’取向。因此，反向靶向序列与引导rna互补但反向。这允许获得单向整合，如hiti方法中已知的。简而言之，在供体dna以相反方向整合的情况下，核酸酶(诸如cas9)将能够再次识别其靶位点并将其裂解。在以正确取向整合后，核酸酶将不再能够裂解靶位点。所述反向靶向序列优选地是相对于位于白蛋白基因的3’末端的选自内含子9、内含子11、内含子12、内含子13和内含子14的区域中的靶序列的反向序列。优选地，所述反向靶向序列中的每一个在其3’处连接至前间区邻近基序(pam)序列。
51、所述外源dna序列还可以包含报告基因，优选地所述报告基因选自discosomared、绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白(rfp)、萤光素酶、β-半乳糖苷酶和β-葡糖醛酸糖苷酶中的至少一种。
52、在一种实施方案中，所述供体核酸还包含以下中的一种或更多种：
53、-转录后调节元件，优选地位于外源dna序列的3’末端；
54、-转录终止序列，优选地位于转录后调节元件的3’末端或外源dna序列的3’末端；
55、-剪接受体序列，优选地位于供体核酸的3’末端，例如与白蛋白外显子连接，如果白蛋白外显子存在的话；
56、-核糖体跳跃序列，优选地位于外源dna序列和白蛋白外显子之间。
57、在一种实施方案中，所述供体核酸还包含以下中的一种或更多种：
58、-剪接受体序列，优选地位于供体核酸的5’末端，例如其与白蛋白外显子连接，如果白蛋白外显子存在的话；
59、-核糖体跳跃序列，优选地位于白蛋白外显子和外源dna序列之间；
60、-转录后调节元件，优选地位于外源dna序列的3’末端；
61、-转录终止序列，优选地位于转录后调节元件的3’末端或外源dna序列的3’末端。
62、优选地，核糖体跳跃序列是t2a、p2a、e2a、f2a，优选地t2a序列。当在细胞中表达时，该序列允许将感兴趣的蛋白与白蛋白隔开。
63、优选地，所述转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)。
64、优选地，所述转录终止序列是多腺苷酸化信号序列，优选地是牛生长激素多腺苷酸(bgh polya)，最优选地是短的合成多腺苷酸。
65、如上所述，供体dna序列在5’和3’侧接grna识别的相同但是反向的grna靶位点(例如反向的靶位点)。
66、优选地，靶向序列包含本文提及的序列之一或其功能片段或基本上具有与本文提及的序列之一或其功能片段具有至少95％同一性的序列，和/或与靶向序列同源的互补链寡核苷酸包含本文提及的序列之一或其功能片段或基本上具有与本文提及的序列之一或其功能片段具有至少95％同一性的序列。
67、优选地，反向靶向序列包含以下或基本上具有与以下具有至少95％同一性的序列：seq id no:20、54或77，或seq id no:2或1，或seq id no:9-18、92-98或54中的任一个。
68、优选地，所述供体核酸包含：
69、-反向靶向序列及其前间区邻近基序(pam)序列；
70、-剪接受体序列
71、-一个或更多个白蛋白外显子，优选地选自外显子13和14的一个或更多个外显子；
72、-核糖体跳跃序列，优选地t2a；
73、-外源dna序列，优选地标志物dsred、人类arsb基因或bdd f8基因的编码序列；
74、-转录终止序列；和
75、-另外的反向靶向序列及其前间区邻近基序(pam)序列。
76、优选地，所述供体核酸包含：
77、-反向靶向序列及其前间区邻近基序(pam)序列；
78、-剪接受体序列
79、-一个或更多个白蛋白外显子，优选地选自外显子10、外显子11、外显子12、外显子13和外显子14的一个或更多个外显子；
80、-核糖体跳跃序列，优选地t2a；
81、-外源dna序列，优选地标志物dsred、人类arsb基因或bdd f8基因的编码序列；
82、-转录终止序列；和
83、-另外的反向靶向序列及其前间区邻近基序(pam)序列。
84、优选地，所述元件按照所列的5’-3’顺序排列，但是其它顺序也同样合适。
85、优选地，所述转录终止序列包含以下或基本上具有与以下具有至少95％同一性的序列：seq id no:26或seq id no:37或seq id no:48或seq id no:65。
86、优选地，所述核糖体跳跃序列包含以下或基本上具有与以下具有至少95％同一性的序列：seq id no:23或63。
87、优选地，所述白蛋白外显子包含以下或基本上具有与以下具有至少95％同一性的序列：seq id no:22和/或78和/或79。
88、优选地，所述剪接受体序列包含以下或基本上具有与以下具有至少95％同一性的序列：seq id no:21。
89、优选地，所述反向靶向序列包含以下或基本上具有与以下具有至少95％同一性的序列：seq id no:1或2或20或54或77，优选地不带有pam序列。
90、所述核酸酶可以作为蛋白质或作为编码所述核酸酶的核酸提供。所述核酸可以是dna或rna，例如它可以是核酸酶的mrna，或者它可以是核酸酶的cdna或dna编码序列或编码核酸酶的dna构建体。
91、优选地，编码核酸酶的所述核酸是包含编码cas9或spcas9的核酸的dna构建体，所述核酸优选地受组织特异性启动子(例如肝脏特异性启动子，如肝脏杂合肝脏启动子(hybrid liver promoter，hlp))的控制。所述构建体还可以包含多腺苷酸，方便地是短的合成多腺苷酸(synt.polya)。所有这些元件都是本领域熟知的，并且可以具有常规的核苷酸序列。编码核酸酶的示例性dna构建体包含以下或基本上具有与以下具有至少95％同一性的序列：seq id no:43、47或52。
92、所述核酸酶优选地选自：crispr核酸酶、talen、dna引导的核酸酶、兆核酸酶和锌指核酸酶，优选地所述核酸酶是选自由以下组成的组的crispr核酸酶：cas9、cpf1、cas12b(c2c1)、cas13a(c2c2)、cas3、csf1、cas13b(c2c6)和c2c3或其变体，诸如sacas9、vqr-cas9-hf1或dcas9。
93、优选地，细胞与编码所述核酸酶的核酸接触，优选地编码所述核酸酶的所述核酸受组织特异性启动子(例如肝脏特异性杂合肝脏启动子(hlp))的控制。
94、优选地，编码所述核酸酶的核酸受组织特异性启动子的控制，最优选地肝脏特异性启动子，例如肝细胞特异性启动子，例如肝脏特异性杂合肝脏启动子(hlp)。
95、适当地，所述供体核酸、与靶向序列同源的所述互补链寡核苷酸和编码所述核酸酶的所述核酸被包含在dna构建体中。优选地，第一dna构建体包含供体核酸和与靶向序列同源的互补链寡核苷酸，并且第二dna构建体包含编码识别所述靶向序列的核酸酶的核酸。可选择地，第一dna构建体包含供体核酸，并且第二dna构建体包含与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和编码识别所述靶向序列的核酸酶的核酸。作为另外的可选择的方案，提供了三种构建体：包含供体核酸的第一构建体、包含与靶向序列同源的互补链寡核苷酸的第二构建体和包含编码识别所述靶向序列的核酸酶的核酸的第三构建体。
96、所述构建体也是本发明的目的。
97、优选地，所述dna构建体的一种或更多种被包含在载体中，优选地病毒载体，还优选地慢病毒载体或腺相关病毒载体。或者，可以将所有或一些所述dna构建体插入非病毒载体中，其中所述非病毒载体选自基于聚合物的、基于颗粒的、基于脂质的、基于肽的递送媒介物或其组合，诸如阳离子聚合物、胶束、脂质体、外来体、微粒和包括脂质纳米颗粒(lnp)的纳米颗粒。
98、所述载体也是本发明的目的。
99、所述互补链寡核苷酸、所述供体核酸和所述编码核酸酶的核酸可以被包含在一种或更多种病毒或非病毒载体中，优选地所述病毒载体选自：腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒和腺病毒。这意味着它们可以在相同或不同的载体中。优选地，细胞选自由以下组成的组：肝脏细胞，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、内皮细胞、上皮细胞、肝细胞、骨细胞、血小板、脂肪细胞、心肌细胞、神经元、视网膜细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、精母细胞、卵母细胞和胰腺细胞、诱导多能干细胞(ips细胞)、干细胞、造血干细胞、造血祖干细胞中的一种或更多种，优选地，细胞是受试者的肝细胞。本发明的另一个目的是通过上述方法可获得的细胞。
100、所述细胞可以用作药物或用于在治疗遗传疾病中使用或在治疗隐性遗传性和常见疾病中使用，优选地所述疾病包括糖尿病、溶酶体贮积病，包括黏多糖贮积症(mpsi、mpsii、mpsiiia、mpsiiib、mpsiiic、mpsiva、mpsivb、mpsvi、mpsvii)、鞘脂贮积症(法布里病(fabry's disease)、戈谢病(gaucher disease)、尼曼-皮克病(nieman-pick disease)、gm1神经节苷脂贮积病)、脂褐质贮积症(巴顿病(batten's disese)等)和黏脂贮积症；脉络膜和视网膜回状萎缩、腺苷酸基琥珀酸缺乏症、血友病a和b、ala脱水酶缺乏症、肾上腺脑白质营养不良。
101、本发明的细胞可以用于在治疗疾病中使用，其中突变体和野生型等位基因两者都被由供体dna提供的基因的正确拷贝替代，或用于治疗由于功能丧失引起的隐性遗传和常见疾病，优选地所述疾病选自：血友病；糖尿病；溶酶体贮积病，包括黏多糖贮积症，诸如mpsi、mpsii、mpsiiia、mpsiiib、mpsiiic、mpsiva、mpsivb、mpsvi和mpsvii，鞘脂贮积症，诸如法布里病、戈谢病、尼曼-皮克病和gm1神经节苷脂贮积病，脂褐质贮积症，诸如巴顿病，和黏脂贮积症；脉络膜和视网膜回状萎缩、腺苷酸基琥珀酸缺乏症、血友病a和b、ala脱水酶缺乏症、肾上腺脑白质营养不良。
102、因此，本发明的细胞可以用于治疗：血友病；糖尿病；溶酶体贮积病，包括黏多糖贮积症，诸如mpsi、mpsii、mpsiiia、mpsiiib、mpsiiic、mpsiva、mpsivb、mpsvi和mpsvii，鞘脂贮积症，诸如法布里病、戈谢病、尼曼-皮克病和gm1神经节苷脂贮积病，脂褐质贮积症，诸如巴顿病，和黏脂贮积症；脉络膜和视网膜的回状萎缩、腺苷酸基琥珀酸缺乏症、血友病a和b、ala脱水酶缺乏症或肾上腺脑白质营养不良。
103、根据本发明可获得的细胞表达外源dna序列。合适地，根据本发明可获得的细胞也表达全长白蛋白编码序列。
104、当供体核酸接触细胞时，供体核酸通常经由非同源末端连接被插入到靶基因中。
105、本发明的另外的目的是一种系统，包含：
106、a)供体核酸，包含：
107、-外源dna序列
108、-任选地一个或更多个白蛋白外显子
109、其中所述供体核酸在5’和3’侧接反向靶向序列；
110、b)与靶向序列同源的互补链寡核苷酸，和
111、c)识别所述靶向序列的核酸酶，
112、其中所述靶向序列位于白蛋白基因的3’末端的选自内含子9、内含子11、内含子12、内含子13和内含子14的区域中。
113、本发明的另外的目的是一种系统，包含：
114、a)供体核酸，包含：
115、-外源dna序列
116、-任选地一个或更多个白蛋白外显子
117、其中所述供体核酸在5’和3’侧接反向靶向序列；
118、b)与靶向序列同源的互补链寡核苷酸，和
119、c)识别所述靶向序列的核酸酶，
120、其中所述靶向序列位于白蛋白基因的3’末端的选自内含子12、内含子13和内含子14的区域中。
121、所述核酸酶可以作为蛋白质或作为编码所述核酸酶的核酸提供。所述核酸可以是dna或rna，例如它可以是核酸酶的mrna，或者它可以是核酸酶的cdna或dna编码序列或编码核酸酶的dna构建体。
122、在一种实施方案中，所述核酸酶由核酸编码，并且所述供体核酸、所述互补链寡核苷酸和所述编码核酸酶的核酸位于dna构建体上，优选地，所述供体核酸和所述互补链寡核苷酸位于相同的dna构建体上，而所述编码核酸酶的核酸位于单独的dna构建体上。优选地，包含所述供体核酸和所述互补链寡核苷酸的所述构建体包含以下序列或基本上具有与包含以下序列的序列具有至少95％同一性的序列：seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:33、seq id no:26、seq id no:20、seq id no:27、seq idno:1和seq id no:28。
123、在另一种实施方案中，包含所述供体核酸的所述构建体包含以下或基本上具有与包含以下序列的序列具有至少95％同一性的序列：seq id no:20、seq id no:21、seq idno:22、seq id no:23、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:20。
124、包含所述供体核酸和所述互补链寡核苷酸的构建体可以包含seq id no:34或基本上具有与seq id no:34具有至少95％同一性的序列。
125、包含所述供体核酸的所述构建体可以包含seq id no:38或基本上具有与seq idno:38具有至少95％同一性的序列。
126、在优选的实施方案中，供体核酸和/或外源dna序列和/或白蛋白外显子和/或反向靶向序列和/或靶向序列和/或互补链寡核苷酸和/或核酸酶和/或其中内含子如上文或本文所定义。
127、本发明的另一个目的是用于制备病毒载体颗粒的方法，包括将这样的dna构建体引入宿主细胞中，并且获得病毒载体颗粒也是本发明的一个目的。
128、在优选的实施方案中，供体核酸和/或外源dna序列和/或靶向序列和/或互补链寡核苷酸和/或核酸酶如上文所定义。
129、在优选的实施方案中，供体核酸和/或外源dna序列和/或白蛋白外显子和/或反向靶向序列和/或靶向序列和/或互补链寡核苷酸和/或核酸酶和/或其中内含子如上文或本文所定义。
130、在本发明的上下文中，供体核酸和/或互补链寡核苷酸和/或编码核酸酶的核酸被包含在一种或更多种病毒或非病毒载体中，优选地所述病毒载体选自：腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒和慢病毒；所述非病毒载体优选地选自基于聚合物的、基于颗粒的、基于脂质的、基于肽的递送媒介物或其组合，诸如阳离子聚合物、胶束、脂质体、外来体、微粒和包括脂质纳米颗粒(lnp)的纳米颗粒。
131、优选地，第一载体包含供体核酸和与靶向序列同源的互补链寡核苷酸，并且第二载体包含编码识别所述靶向序列的核酸酶的核酸。可选择地，第一载体包含供体核酸，并且第二载体包含与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和编码识别所述靶向序列的核酸酶的核酸。作为另外的可选择的方案，提供了三种载体：包含供体核酸的第一载体、包含与靶向序列同源的互补链寡核苷酸的第二载体和包含编码识别所述靶向序列的核酸酶的核酸的第三载体。
132、优选地，该系统包含第一载体和第二载体，第一载体包含表达核酸酶的核酸，并且第二载体包含供体核酸和与靶向序列同源的互补链寡核苷酸，其中这样的元件如上文或本文所定义。
133、优选地，该系统包含第一载体和第二载体，第一载体包含供体核酸，并且第二载体包含与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和编码核酸酶的核酸，其中这样的元件如上文或本文所定义。根据本发明的系统优选地用于医学用途，优选地用于在治疗遗传疾病中使用或用于在治疗由于功能丧失引起的遗传性和常见疾病中使用，优选地所述疾病包括糖尿病、溶酶体贮积病，包括黏多糖贮积症(mpsi、mpsii、mpsiiia、mpsiiib、mpsiiic、mpsiva、mpsivb、mpsvi、mpsvii)、鞘脂贮积症(法布里病、戈谢病、尼曼-皮克病、gm1神经节苷脂贮积病)、脂褐质贮积症(巴顿病等)和黏脂贮积症；脉络膜和视网膜回状萎缩、腺苷酸基琥珀酸缺乏症、血友病a和b、ala脱水酶缺乏症、肾上腺脑白质营养不良。
134、本发明的系统可以用于在治疗疾病中使用，其中突变体和野生型等位基因两者都被由供体dna提供的基因的正确拷贝替代，或用于治疗由于功能丧失引起的隐性遗传和常见疾病，优选地所述疾病选自：血友病；糖尿病；溶酶体贮积病，包括黏多糖贮积症，诸如mpsi、mpsii、mpsiiia、mpsiiib、mpsiiic、mpsiva、mpsivb、mpsvi和mpsvii，鞘脂贮积症，诸如法布里病、戈谢病、尼曼-皮克病和gm1神经节苷脂贮积病，脂褐质贮积症，诸如巴顿病，和黏脂贮积症；脉络膜和视网膜回状萎缩、腺苷酸基琥珀酸缺乏症、血友病a和b、ala脱水酶缺乏症、肾上腺脑白质营养不良。
135、因此，本发明的系统可以用于治疗：血友病；糖尿病；溶酶体贮积病，包括黏多糖贮积症，诸如mpsi、mpsii、mpsiiia、mpsiiib、mpsiiic、mpsiva、mpsivb、mpsvi和mpsvii，鞘脂贮积症，诸如法布里病、戈谢病、尼曼-皮克病和gm1神经节苷脂贮积病，脂褐质贮积症，诸如巴顿病，和黏脂贮积症；脉络膜和视网膜回状萎缩、腺苷酸基琥珀酸缺乏症、血友病a和b、ala脱水酶缺乏症或肾上腺脑白质营养不良。
136、本发明的另外的目的是载体，载体包含供体核酸和/或与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和/或编码识别如上或本文所定义的靶向序列的核酸酶的核酸。
137、在本发明的上下文中，优选地供体核酸和/或外源dna序列和/或白蛋白外显子和/或反向靶向序列和/或靶向序列和/或互补链寡核苷酸和/或核酸酶和/或其中内含子如上文或本文所定义。
138、优选地，载体是病毒载体，优选地慢病毒载体或腺相关病毒载体，或非病毒载体，优选地选自基于聚合物的、基于颗粒的、基于脂质的、基于肽的递送媒介物或其组合，诸如阳离子聚合物、胶束、脂质体、外来体、微粒和包括脂质纳米颗粒(lnp)的纳米颗粒。优选地使用aav2/8载体。
139、在本发明的一种优选的实施方案中，包含表达cas9的核酸的一种载体与包含供体dna和与靶向序列同源的互补链寡核苷酸(即如上定义的grna)的第二载体一起使用。
140、在本发明的可选地优选实施方案中，包含表达cas9的核酸和与靶向序列同源的互补链寡核苷酸(即grna)的一种载体与包含如上定义的供体dna的第二载体一起使用。
141、优选地，第一载体包含编码cas9或spcas9的核酸，优选地受组织特异性启动子(例如肝脏特异性启动子，如肝脏杂合肝脏启动子(hlp))的控制。所述载体还可以包含多腺苷酸，方便地是短的合成多腺苷酸(synt.polya)。优选地，第二载体包含如上定义的grna表达盒和供体dna。优选地，grna表达盒在u6启动子下包含如上定义的grna。优选地，供体dna在3’和5’处侧接反向靶向序列，优选地与相应的pam连接。
142、优选地，载体是病毒载体，优选地，病毒载体是慢病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体、基于鼠maloney的病毒载体、α病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、杆状病毒载体或细小病毒载体，优选地，腺相关病毒是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aavsh19、aavphp.baav2、aav9、aav1、aavsh19、aavphp.b、aav8、aav6。
143、优选地，病毒载体或载体还包含5’-末端重复(5’-tr)核苷酸序列和3’-末端重复(3’-tr)核苷酸序列，优选地5’-tr是5’-反向末端重复(5’-itr)核苷酸序列，并且3’-tr是3’-反向末端重复(3’-itr)核苷酸序列，优选地itr来源于相同病毒血清型或不同病毒血清型，优选地病毒是aav，优选地具有血清型2。
144、在一种实施方案中，包含grna表达盒和供体dna的所述病毒载体还包含优选地位于包含grna表达盒和供体dna的构建体的5’末端的优选地aav的5’反向末端重复(itr)序列和优选地位于包含grna表达盒和供体dna的构建体的3’末端的优选地aav的3’反向末端重复(itr)序列。
145、优选地，所述itr包含包含以下或具有与以下具有至少95％同一性的序列：seq idno:110、seq id no:29或66。
146、优选地，所述包含grna表达盒和供体dna的病毒载体包含：
147、-aav 5’-反向末端重复(5’-itr)序列；
148、-与其前间区邻近基序(pam)序列连接的反向靶向序列；
149、-剪接受体序列；
150、-一个或更多个白蛋白外显子，优选地选自外显子10、外显子11、外显子12、外显子13和外显子14的一个或更多个外显子；
151、-核糖体跳跃序列，优选地t2a，
152、-外源dna序列，优选地人类arsb基因的编码序列；
153、-转录终止序列；
154、-与其前间区邻近基序(pam)序列连接的另外的反向靶向序列；
155、-与靶向序列同源的互补链寡核苷酸，受启动子，优选地受u6启动子的控制；
156、-嵌合grna支架，和
157、-aav 3’-反向末端重复(3’-itr)序列。
158、优选地，所述包含grna表达盒和供体dna的病毒载体包含：
159、-aav 5’-反向末端重复(5’-itr)序列；
160、-与其前间区邻近基序(pam)序列连接的反向靶向序列；
161、-剪接受体序列；
162、-一个或更多个白蛋白外显子，优选地选自外显子13和14的一个或更多个外显子；
163、-核糖体跳跃序列，优选地t2a，
164、-外源dna序列，优选地人类arsb基因的编码序列；
165、-转录终止序列；
166、-与其前间区邻近基序(pam)序列连接的另外的反向靶向序列；
167、-与靶向序列同源的互补链寡核苷酸，受启动子，优选地受u6启动子的控制；
168、-嵌合grna支架，和
169、-aav 3’-反向末端重复(3’-itr)序列。
170、可选择地，所述包含供体dna的病毒载体包含：
171、-aav 5’-反向末端重复(5’-itr)序列；
172、-与其前间区邻近基序(pam)序列连接的反向靶向序列；
173、-剪接受体序列；
174、-一个或更多个白蛋白外显子，优选地选自外显子10、外显子11、外显子12、外显子13和外显子14的一个或更多个外显子；
175、-核糖体跳跃序列，优选地t2a，
176、-外源dna序列，优选地人类bdd f8基因的编码序列；
177、-转录终止序列；
178、-与其前间区邻近基序(pam)序列连接的另外的反向靶向序列；和
179、-aav 3’-反向末端重复(3’-itr)序列
180、或者
181、所述包含供体dna的病毒载体包含：
182、-aav 5’-反向末端重复(5’-itr)序列；
183、-与其前间区邻近基序(pam)序列连接的反向靶向序列；
184、-剪接受体序列；
185、-一个或更多个白蛋白外显子，优选地选自外显子13和14的一个或更多个外显子；
186、-核糖体跳跃序列，优选地t2a，
187、-外源dna序列，优选地人类bdd f8基因的编码序列；
188、-转录终止序列；
189、-与其前间区邻近基序(pam)序列连接的另外的反向靶向序列；和
190、-aav 3’-反向末端重复(3’-itr)序列。
191、适当地，当所述载体不包含grna表达盒时，所述盒被包含在包含表达核酸酶的核酸的载体中。
192、上述元件可以按照上面定义的顺序，从5’到3’，然而，如本领域技术人员可以理解的，其他顺序同样合适。
193、载体还可以包含另外的病毒序列，诸如另外的aav序列。
194、优选地，包含所述供体核酸和所述互补链寡核苷酸的所述载体包含以下序列或基本上具有与包含以下序列的序列具有至少95％同一性的序列：seq id no:29、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:33、seq id no:26、seq idno:20、seq id no:27、seq id no:2、seq id no:28和seq id no:29。
195、在另一种实施方案中，包含所述供体核酸的所述载体包含以下序列或基本上具有与包含以下序列的序列具有至少95％同一性的序列：seq id no:110、seq id no:20、seqid no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:20和seq id no:29。
196、本发明的另一个目的是包含如上定义的构建体、载体或载体系统或系统的宿主细胞。
197、本发明的另一个目的是包含如上定义的构建体、载体、载体系统或系统的病毒颗粒。
198、合适地，如本文所定义的病毒载体涵盖病毒载体颗粒。
199、术语“病毒颗粒(virus particle)”或“病毒颗粒(viral particle)”旨在意指非致病性病毒的细胞外形式，特别是病毒载体，其由从被称为衣壳的蛋白质外壳包围的dna或rna制成的遗传物质组成，并且在一些情况下，包膜来源于宿主细胞膜的部分并包括病毒糖蛋白。
200、如本文使用的，病毒载体还指病毒载体颗粒。
201、本发明涵盖的病毒载体适用于基因治疗。
202、优选地，病毒颗粒包含aav的衣壳蛋白。
203、优选地，病毒颗粒包含选自由aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aavsh19、aavphp.b组成的组的一种或更多种的血清型的aav的衣壳蛋白；优选地来自aav2或aav8血清型。
204、本发明的另一个目的是一种药物组合物，包含以下之一：如上定义的系统；一种或更多种载体；宿主细胞或病毒颗粒；和药学上可接受的运载体。
205、本发明的另一个目的是试剂盒，包含：在一个或更多个容器中的如上定义的dna构建体、系统或一种或更多种载体或宿主细胞或病毒颗粒或如上定义的药物组合物，任选地还包含描述如何向患者施用核酸构建体、载体、宿主细胞、病毒颗粒或药物组合物的说明书或包装材料。
206、如上定义的系统或一种或更多种载体或宿主细胞或病毒颗粒或如上定义的药物组合物优选地用作药物，优选地用于在治疗本文提及的疾病中使用，优选地在治疗以下疾病中使用：肝病；溶酶体贮积病，包括黏多糖贮积症(诸如mpsi、mpsii、mpsiiia、mpsiiib、mpsiiic、mpsiva、mpsivb、mpsvi、mpsvii)、鞘脂贮积症(法布里病、戈谢病、尼曼-皮克病、gm1神经节苷脂贮积病)、脂褐质贮积症(巴顿病等)和黏脂贮积症；其中肝脏可以用作用于产生和/或分泌治疗性蛋白质的工厂的其他疾病，如糖尿病、脉络膜和视网膜的回状萎缩、腺苷酸琥珀酸缺乏症、血友病a和b、ala脱水酶缺乏症、肾上腺脑白质营养不良。
207、如上定义的系统或一种或更多种载体或宿主细胞或病毒颗粒或如上定义的药物组合物可以用于在治疗疾病中使用，其中突变体和野生型等位基因两者都被由供体dna提供的基因的正确拷贝替代，或用于治疗由于功能丧失引起的隐性遗传和常见疾病，优选地所述疾病选自：血友病；糖尿病；溶酶体贮积病，包括黏多糖贮积症，诸如mpsi、mpsii、mpsiiia、mpsiiib、mpsiiic、mpsiva、mpsivb、mpsvi和mpsvii，鞘脂贮积症，诸如法布里病、戈谢病、尼曼-皮克病和gm1神经节苷脂贮积病，脂褐质贮积症，诸如巴顿病，和黏脂贮积症；脉络膜和视网膜回状萎缩、腺苷酸基琥珀酸缺乏症、血友病a和b、ala脱水酶缺乏症、肾上腺脑白质营养不良。
208、因此，如上定义的系统或一种或更多种载体或宿主细胞或病毒颗粒或如上定义的药物组合物可以用于治疗：血友病；糖尿病；溶酶体贮积病，包括黏多糖贮积症，诸如mpsi、mpsii、mpsiiia、mpsiiib、mpsiiic、mpsiva、mpsivb、mpsvi和mpsvii，鞘脂贮积症，诸如法布里病、戈谢病、尼曼-皮克病和gm1神经节苷脂贮积病，脂褐质贮积症，诸如巴顿病，和黏脂贮积症；脉络膜和视网膜回状萎缩、腺苷酸基琥珀酸缺乏症、血友病a和b、ala脱水酶缺乏症或肾上腺脑白质营养不良。
209、本发明的另一个目的是如上定义的用于产生病毒颗粒的构建体。
210、本发明的另一个目的是用于治疗受本文提及的疾病(优选地由于基因功能丧失引起的遗传性疾病)影响的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如上定义的载体系统或载体或宿主细胞或病毒颗粒或药物组合物。优选地，所述疾病是溶酶体贮积病，诸如黏多糖贮积症(mpsi、mpsii、mpsiiia、mpsiiib、mpsiiic、mpsiva、mpsivb、mpsvi、mpsvii)或血友病a或b。
211、优选地，本发明的目的是本文提及的序列。
212、优选地，供体dna盒元件和/或grna表达盒元件和/或启动子序列和/或用于grna表达的u6启动子和/或grna和/或grna靶位点和/或反向靶向序列和/或cas9和/或外源dna序列和/或转录后调节元件和/或转录终止序列和/或剪接受体序列和/或核糖体跳跃序列是以下序列seq id no:1-109中描绘的序列。
213、本发明的另一个目的是dna构建体，包含如上文或本文所定义的供体核酸和/或与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和/或编码识别所述靶向序列的核酸酶的核酸。
214、在一种实施方案中，本发明的方法是离体或在体外的。
215、在一种实施方案中，在本发明的方法中，细胞是来自受试者或患者的分离的细胞。
216、白蛋白的序列优选地用以下登录号ac140220.4(genebank，ncbi，数据库；最新版本)或用以下登录号nc_000004.12描述。
217、本发明还提供了药物组合物，包含如上定义的核酸或如上定义的核苷酸序列或如上定义的载体以及药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂和/或运载体。
218、优选地，所述组合物还包含治疗剂，优选地，所述治疗剂选自由以下组成的组：酶替代疗法和小分子疗法。
219、优选地，药物组合物通过选自由以下组成的组的途径施用：肠胃外、静脉内(例如通过颞静脉)、腹膜内、瘤内、肝内或其任何组合。优选地，本发明的载体通过静脉内或肠胃外途径施用。
220、本发明还提供了用于医学用途的如上定义的载体，其中所述载体通过选自由以下组成的组的途径施用：肠胃外、静脉内(例如通过颞静脉)、腹膜内、瘤内、肝内或其任何组合。优选地，本发明的载体通过静脉内或肠胃外途径施用。
221、在本发明的优选的实施方案中：
222、-如果靶向序列位于白蛋白基因的内含子9中，则存在白蛋白外显子10、11、12、13和14或其片段；
223、-如果靶向序列位于白蛋白基因的内含子11中，则存在白蛋白外显子12、13和14或其片段；
224、-如果靶向序列位于白蛋白基因的内含子12中，则存在白蛋白外显子13和14或其片段；
225、-如果靶向序列位于白蛋白基因的内含子13中，则存在白蛋白外显子14或其片段；或
226、-如果靶向序列位于白蛋白基因的内含子14中，则不存在白蛋白外显子或其片段。
227、在本发明中，可以存在3xflag序列，优选地，3xflag序列包含seq id no:56或62或基本上具有与seq id no:56或62具有至少95％同一性的序列。
228、在本发明中，“至少80％同一性”意指，同一性可以是与所述序列的至少80％、或85％、或90％、或95％或100％序列同一性。这适用于所有提到的同一性％。在本发明中，“至少95％同一性”意指，同一性可以是与所述序列的至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。这适用于所有提到的同一性％。在本发明中，“至少98％同一性”意指，同一性可以是与所述序列的至少98％、99％或100％序列同一性。这适用于所有提到的同一性％。优选地，同一性％涉及所述序列的全长。
229、本发明还包括衍生自本文提及的核苷酸序列的核酸序列，例如功能性片段、突变体、变体、衍生物、类似物和与本文提及的序列具有至少80％的同一性％的序列。
1.一种将外源dna序列整合到细胞的基因组中的方法，包括使所述细胞与以下接触：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体核酸包含一个或更多个白蛋白外显子，并且所述外显子是外显子13和/或外显子14或其片段。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体核酸包含一个或更多个白蛋白外显子，并且所述外显子是外显子10和/或外显子11和/或外显子12和/或外显子13和/或外显子14或其片段。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与靶向序列同源的所述互补链寡核苷酸是与位于所述白蛋白基因的内含子9、内含子11、内含子12、内含子13或内含子14内的靶向序列或其互补链杂交的引导rna，优选地所述引导rna与前间区邻近基序(pam)序列相邻。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述白蛋白基因是人类基因或鼠基因。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中与所述靶向序列同源的所述互补链寡核苷酸受启动子，优选地受u6启动子的控制。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述外源dna序列是芳基硫酸酯酶b(arsb)基因的编码序列，优选地所述arsb的编码序列包含seq id no:33或基本上具有与seq id no:33具有至少95％同一性的序列。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述外源dna序列是因子8(f8)基因的编码序列，优选地所述f8的编码序列包含seq id no:36或55或基本上具有与seq id no:36或55具有至少95％同一性的序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述反向靶向序列是相对于位于所述白蛋白基因的3’末端的选自内含子9、内含子11、内含子12、内含子13和内含子14的区域中的靶序列的反向序列，优选地所述反向靶向序列在其3’处连接至前间区邻近基序(pam)序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述供体核酸还包含以下中的一种或更多种：
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述核糖体跳跃序列是t2a、p2a、e2a、f2a，优选地t2a序列和/或所述转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)和/或所述转录终止序列是多腺苷酸化信号序列，优选地牛生长激素多腺苷酸(bgh polya)。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述靶向序列包含seq id no:1-2、seq id no:9-18中的任一个或其功能片段或基本上具有与seq id no:1-2、seq id no:9-18中的任一个或其功能片段具有至少95％同一性的序列，和/或与所述靶向序列同源的所述互补链寡核苷酸包含seq id no:1-2、seq id no:9-18中的任一个或其功能片段或基本上具有与seq id no:1-2、seq id no:9-18中的任一个或其功能片段具有至少95％同一性的序列。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述供体核酸包含：
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述核酸酶优选地选自：crispr核酸酶、talen、dna引导的核酸酶、兆核酸酶和锌指核酸酶，优选地所述核酸酶是选自由以下组成的组的crispr核酸酶：cas9、cpf1、cas12b(c2c1)、cas13a(c2c2)、cas3、csf1、cas13b(c2c6)和c2c3或其变体，诸如sacas9或vqr-cas9-hf1。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述细胞与编码所述核酸酶的核酸接触，优选地编码所述核酸酶的所述核酸受组织特异性启动子，例如肝脏特异性杂合肝脏启动子(hlp)的控制。
16.根据权利要求1-15中任一项的方法，其中所述互补链寡核苷酸、所述供体核酸和编码所述核酸酶的核酸被包含在病毒载体或非病毒载体中，优选地所述病毒载体选自：腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒和腺病毒。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组：肝脏细胞，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、内皮细胞、上皮细胞、肝细胞、骨细胞、血小板、脂肪细胞、心肌细胞、神经元、视网膜细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、精母细胞、卵母细胞和胰腺细胞、诱导多能干细胞(ips细胞)、干细胞、造血干细胞、造血祖干细胞中的一种或更多种，优选地所述细胞是受试者的肝细胞。
18.通过权利要求1-17所述的方法可获得的细胞，用于治疗疾病，其中突变体等位基因和野生型等位基因两者都被由所述供体dna提供的所述基因的正确拷贝替代，或用于治疗由于功能丧失引起的隐性遗传和常见疾病，优选地所述疾病选自：血友病；糖尿病；溶酶体贮积病，包括黏多糖贮积症，诸如mpsi、mpsii、mpsiiia、mpsiiib、mpsiiic、mpsiva、mpsivb、mpsvi和mpsvii，鞘脂贮积症，诸如法布里病、戈谢病、尼曼-皮克病和gm1神经节苷脂贮积病，脂褐质贮积症，诸如巴顿病，和黏脂贮积症；脉络膜和视网膜回状萎缩、腺苷酸基琥珀酸缺乏症、血友病a和b、ala脱水酶缺乏症、肾上腺脑白质营养不良。
19.一种系统，包含：
20.根据权利要求19所述的系统，其中所述核酸酶由核酸编码，并且所述供体核酸、所述互补链寡核苷酸和编码所述核酸酶的所述核酸位于dna构建体上，优选地所述供体核酸和所述互补链寡核苷酸位于相同的dna构建体上，而编码所述核酸酶的所述核酸位于单独的dna构建体上。
21.根据权利要求19-20中任一项所述的系统，其中所述供体核酸和/或所述外源dna序列和/或所述靶向序列和/或所述互补链寡核苷酸和/或所述核酸酶根据权利要求1-16中任一项所定义。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的系统，其中所述互补链寡核苷酸和/或所述供体核酸和/或编码所述核酸酶的核酸被包含在一种或更多种病毒载体或非病毒载体中，优选地所述病毒载体选自：腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒和慢病毒。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述系统包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含表达核酸酶的核酸，并且所述第二载体包含所述供体核酸和与所述靶向序列同源的所述互补链寡核苷酸，其中这样的元件根据权利要求1-16中任一项所定义。
24.根据权利要求22所述的系统，其中所述系统包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含所述供体核酸，并且所述第二载体包含与靶向序列同源的所述互补链寡核苷酸和编码所述核酸酶的所述核酸，其中这样的元件根据权利要求1-16中任一项所定义。
25.根据权利要求19-24中任一项所述的系统，用作药物。
26.一种载体，包含根据权利要求1-16中任一项所定义的供体核酸和/或与所述靶向序列同源的所述互补链寡核苷酸和/或编码识别所述靶向序列的核酸酶的核酸。
27.根据权利要求26所述的载体，其中所述载体是病毒载体，优选地慢病毒载体或腺相关病毒载体，或非病毒载体，优选地选自基于聚合物的、基于颗粒的、基于脂质的、基于肽的递送媒介物或其组合，诸如阳离子聚合物、胶束、脂质体、外来体、微粒和包括脂质纳米颗粒(lnp)的纳米颗粒。
28.根据权利要求26或27所述的载体，还包含5’-末端重复(5’-tr)核苷酸序列和3’-末端重复(3’-tr)核苷酸序列，优选地，所述5’-tr是5’-反向末端重复(5’-itr)核苷酸序列，并且所述3’-tr是3’-反向末端重复(3’-itr)核苷酸序列，优选地所述itr来源于相同病毒血清型或不同病毒血清型，优选地所述病毒是aav，优选地具有血清型2。
29.一种宿主细胞，包含根据权利要求19-25中任一项所述的系统或根据权利要求26-28中任一项所述的载体。
30.一种病毒颗粒，包含根据权利要求19-25中任一项所述的系统或根据权利要求26-28中任一项所述的载体。
31.根据权利要求30所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含aav的衣壳蛋白。
32.根据权利要求31所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含aav的衣壳蛋白，所述aav的血清型选自由aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9和aav 10组成的组中的一种或更多种，优选地选自aav2或aav8血清型。
33.一种药物组合物，包含以下之一：根据权利要求19-25中任一项所述的系统，或一种或更多种根据权利要求26-28中任一项所述的载体，根据权利要求29所述的宿主细胞，根据权利要求30-32中任一项所述的病毒颗粒，和药学上可接受的运载体。
34.一种试剂盒，包含：在一个或更多个容器中的根据权利要求19-25中任一项所述的系统、或一种或更多种根据权利要求26-28中任一项所述的载体、根据权利要求29所述的宿主细胞、根据权利要求30-32中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求33所述的药物组合物，任选地还包括描述如何向患者施用所述核酸构建体、载体、宿主细胞、病毒颗粒或药物组合物的说明书或包装材料。
35.根据权利要求19-25中任一项所述的系统、或根据权利要求26-28中任一项所述的载体、根据权利要求29所述的宿主细胞、根据权利要求30-32中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求33所述的药物组合物，用作药物。
36.根据权利要求29-25中任一项所述的系统、或根据权利要求26-28中任一项所述的载体、根据权利要求29所述的宿主细胞、根据权利要求30-32中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求33中任一项所述的药物组合物，用于在治疗以下疾病中使用：肝病；溶酶体贮积病，包括黏多糖贮积症，诸如mpsi、mpsii、mpsiiia、mpsiiib、mpsiiic、mpsiva、mpsivb、mpsvi和mpsvii，鞘脂贮积症，诸如法布里病、戈谢病、尼曼-皮克病和gm1神经节苷脂贮积病，脂褐质贮积症，诸如巴顿病和黏脂贮积症；其中肝脏能够用作产生和/或分泌治疗性蛋白质的工厂的其他疾病，如糖尿病、脉络膜和视网膜的回状萎缩、腺苷酸基琥珀酸缺乏症、血友病a和b、ala脱水酶缺乏症、肾上腺脑白质营养不良。
37.根据权利要求19-25中任一项所述的系统或根据权利要求26-28中任一项所述的载体用于产生病毒颗粒的用途。
38.一种dna构建体，包含根据权利要求1-16中任一项所定义的供体核酸、和/或与靶向序列同源的互补链寡核苷酸和/或编码识别所述靶向序列的核酸酶的核酸。
