本发明涉及一种生产和纯化低聚果糖(fos)的方法以及通过这种方法获得的产品，该产品具有低或无葡萄糖、果糖或蔗糖残留物，该fos具有不同比例的低聚物(gf2、gf3、gf4、gf5和gf6)以及它们的异构体，由于其调节肠道微生物群以及直接和间接免疫调节的优越性能，因此可供动物和人类营养使用。
背景技术：
1、fos或低聚果糖是在人类和动物营养的研究和使用中最受欢迎的益生元低聚糖之一，因为它们具有公认的双歧效应(bifidogeniceffect)。因为发酵后，优选通过肠道中存在的双歧杆菌和乳酸杆菌发酵后，会产生短链脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸和乳酸。这些化合物通过环境酸化间接促进肠道微生物群的调节，有利于有益细菌的生长，而不利于引起肠炎的腐败细菌的生长，所述腐败细菌例如为沙门氏菌属(salmonella)、大肠杆菌属(eschirichia coli)、梭菌属(clostridium)、弯曲杆菌属(campylobacter)和其他病原体的细菌。
2、除了降低肠道ph值外，这些有机酸被肠上皮细胞吸收并用作能量来源，增加粘蛋白(肠上皮的保护性粘膜)的产生，促进肠绒毛的增加，改善营养物质的吸收，它们加强了“紧密连接”，促进了肠上皮具有更大的完整性，此外还促进了代谢的规律化，控制了血糖、甘油三酯和胆固醇的血液水平。
3、微生物群的调节除了有助于生态平衡和平衡肠道中产生的各种激素外，如今还被认为是第二大脑，促进了次级免疫调节效应，因为有益的微生物会激活t细胞，t细胞产生细胞因子，其招募细胞对抗炎症性疾病和病原体，所述细胞因子例如为白细胞介素il-1、il-2、il-4、il-6、il-10等。它们还通过增加b细胞产生的iga、igg和igm抗体，对适应性免疫系统产生作用。
4、最近的研究表明，益生元低聚糖，如长链fos(lcfos)和短链gos(scgos)，直接作用于免疫系统，它们被“工具样受体”(tlr-4)识别，并产生白细胞介素10，从而证明了它们的直接作用，即，即使在肠道的最初始部分，即使它们没有被益生菌发酵或消耗，它们也对先天免疫系统产生了重大影响。
5、fos可以在许多植物和食物中找到，如菊苣(chichorium intybus)、朝鲜蓟、洋姜、雪莲果、洋葱、香蕉、西红柿、大蒜、芦笋、龙舌兰、蜂蜜和甘蔗。它们是储备碳水化合物，并且在植物中具有渗透调节作用。fos的形成归因于环境条件和发育阶段，并且是由低温导致果聚糖在叶子和根部中积累所造成的。
6、fos也由许多微生物产生，如曲霉属(aspergillus)、短梗霉属(aureobasidiumsp.)、镰刀菌属(fusarium)、青霉菌属(penicillium)、绿粘帚菌(gliocladium virens)、嗜热侧孢霉(sporutrichum thermophile)、短帚霉(scopulariopsis brevicaulis)、红酵母属(rhodothorula)、马克斯克鲁维酵母属(klyveromyces marxianus)、红法夫酵母(xanthoplylomyces dendrohous)、西方许旺酵母(schwanniomyces occidentalis)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、芽孢杆菌属(bacillus)和运动发酵单胞菌(zymomonasmobilis)。
7、无论是在植物中还是通过微生物途径，fos的形成都是由于水解酶(ec.3.2.1.26)和转移酶(ec.2.4.1.9)(例如呋喃果糖苷酶和果糖基转移酶)导致的。
8、fos根据链的尺寸和果糖分子之间的键而不同，这取决于其形成酶。根据iupac-iub(国际纯粹与应用化学联合会)的定义，低聚糖是指它们的链中含有3至10个单糖单元的糖类或碳水化合物类。因此，果糖低聚物的组成中可含有最多10个果糖分子。然而，许多作者更喜欢这样定义，即，它们是所包含的聚合度最多为10的分子。高于此值，它们被称为果聚糖多糖或“果聚糖”，在左聚糖和菊粉之间变化，其分子链中可含有最多60个果糖单元。
9、果糖链可含有1f和6g和6f型的键。第一种类型中的果糖单元通过β-2,1型糖苷键连接。6g被称为新低聚果糖(neofos)，它们在果糖和葡萄糖单元之间具有β-2,6型糖苷键。至于6f型，它们在果糖单元之间具有β-2,6型糖苷键。
10、最著名的fos合成过程遵循来自出芽短梗霉(aureobasidium pullulans)的果糖基转移酶作用的数学模型：
11、gfn+gfn→gfn-1+gfn+1n＝1–3
12、(g：葡萄糖，f：果糖，gf：蔗糖)
13、该机制分为三个反应：
14、2 gf → gf2 + g (1)
15、2 gf2 → gf3+ gf (2)
16、2 gf3→ gf4 + gf3 (3)
17、在该模型中，过量的葡萄糖作为果糖基转移酶的抑制剂，从而发挥负反馈效应，即，一旦在反应介质中存在一定量的葡萄糖，反应就会停止。因此，在现有技术中，fos合成过程的最大产率为60％，使蔗糖残留，并且残留的葡萄糖达到很高的水平，占总成分的高达30％，这使得喷雾干燥变得不可行。
18、使用果糖基转移酶的标准fos反应的经典例子为：
19、[gf]→[g]+[f]+[gf]+[gf2+gf3+gf4]
20、40％→12％+1％+3％+24％
21、产率＝[gf2+gf3+gf4]/[gf]＝
22、＝24％/40％＝60％
23、结果是，可以注意到介质中葡萄糖的浓度过高，阻止反应继续发生，甚至可能形成更大的低聚物，如下面的数学例所示：
24、2 gf → gf2 + g (1)
25、2 gf2 → gf3+ gf (2)
26、2 gf3→ gf4 + gf3 (3)
27、2 gf4→ gf5 + gf4 (4)
28、2 gf5→ gf6 + gf5 (5)
29、本发明提出并证明了通过同时除去葡萄糖并合成fos来形成gf5和gf6。
30、为了去除最终的fos糖浆中的葡萄糖，现有技术中最常用的方法是使用色谱柱。通过尺寸排阻(离子筛)，去除分子量较低的糖类，如葡萄糖、果糖和蔗糖，直到纯化的糖浆中的fos纯度达到100％、最终产品中的fos纯度达到95％。图1和图2示出了传统fos生产方法的纯化步骤与本发明方法的对比。
31、另一方面，本发明提供了一种替代方案，其通过使用完整的微生物进行生物转化过程，以实现合成fos并且通过从反应介质中去除葡萄糖和其他残留糖来纯化该fos的双重目的。因此，除了负责合成fos的短梗霉属外，还使用了酿酒酵母，该酿酒酵母只选择性地消耗葡萄糖和果糖，而不消耗蔗糖和fos(即具有α,1-2和β,2-1键的低聚物)。因此，蔗糖转化率提高到最低70％，没有观察到残留蔗糖的存在，并且由于乙醇在喷雾干燥器干燥过程中完全蒸发，因此在糖浆和最终产品中，fos浓度达到最低值为80％至90％。
32、fos糖浆中葡萄糖的浓度大于3％时不允许使用喷雾干燥技术进行干燥工序。这是由于低分子量的糖(如葡萄糖和果糖)的玻璃化转变(t.g.)度数低，而聚合度较高的糖类(如蔗果三糖(gf2)、蔗果四糖(gf3)和蔗果五糖(gf4))则不会出现这种情况。与通过色谱法分离葡萄糖(如当前现有技术所做的那样)相比，通过微生物工艺除去葡萄糖的成本较低。
33、现有技术文献jph 04293494教导了在受体存在下，通过用果糖基转移酶和转化酶缺陷型酵母处理蔗糖，以低成本有效地生产可用于医药和食品领域的含果糖低聚糖或糖苷。在受体(例如乳糖)存在下将蔗糖溶于水中，与β-呋喃果糖苷酶(一种由节杆菌属k-1(arthrobacter sp.k-1)产生的果糖基转移酶)反应，同时与转化酶缺陷型酵母反应，反应条件为ph 6.5-7.0、35℃，反应时间为20小时，用硅藻土过滤去除转化酶缺陷型酵母，将滤液在95℃下用活性炭处理1小时，用离子交换树脂纯化，浓缩并喷雾干燥，得到含果糖的低聚糖(包括乳糖基果糖苷)或含果糖的糖苷(例如果糖基甜菊苷)。
34、然而，本发明的不同之处在于，本发明解决了以下问题并取得了不同寻常的结果。
35、解决的问题
36、本发明解决了本领域技术人员在获得低聚果糖(fos)的方法中达到更好的产率、主要是更优的纯度的问题，这归因于消除了葡萄糖、果糖或蔗糖残留物、以及一些副产物，这些副产物使得难以获得更优的纯度，并且主要是使所得最终产品的纯化条件更加昂贵。此外，本发明通过在喷雾干燥器干燥阶段从最终产品中除去醇类、特别是乙醇，从而以可持续的方式优化了最终产品的获得。
37、本发明的非同寻常的效果
38、本发明除了获得纯度更高的最终产品、以及使用比本领域技术人员所用的更可持续的方法和更经济的设备和条件外，还允许获得含有更多长链低聚物(如gf5和gf6)的最终产品，这对于到达大肠最远端部分中的双歧杆菌和乳酸杆菌菌落而言非常重要，而短链低聚物gf2、gf3和gf4则无法到达。这是可能的，因为这两种微生物(短梗霉和酿酒酵母)能够共同生存，并在该方法中同时共同作用。
39、发明目的
40、开发了一种使用酵母获得并纯化低聚果糖(fos)的方法，该方法旨在呈现：
41、-将蔗糖直接生物转化为fos，具有高的转化率和产率；
42、-微生物除去葡萄糖；
43、-微生物除去葡萄糖，这归功于使用不产生细胞外转化酶的酿酒酵母，该酵母是通过使用crispr cas9方法获得的；
44、-低聚果糖的生产成本更低；
45、-所得的含低聚果糖的糖浆可直接干燥；
46、-生产含有不同比例的短链低聚物(scfos如gf2、gf3、gf4)和大量的长链低聚物(lcfos如gf5和/或gf6)以及它们的异构体的fos；
47、-除了作为直接免疫调节剂外，还可以生产低聚物比例更适合每种使用目的的fos，包括更有效的功能性生理作用、对微生物群的更大的调节作用和对生态平衡的更大的促进作用；
48、-比本领域技术人员使用的方法更可持续。
技术实现思路
1、本发明涉及一种生产和纯化低聚果糖的方法，该方法同时或分开使用至少两种微生物或酵母，以将蔗糖转化为低聚果糖(fos)并且完全消耗介质中的葡萄糖，并在最终产品的干燥过程中蒸发酒精或乙醇，从而获得最终产品，所述两种微生物或酵母中的一种微生物或酵母不能在含有蔗糖的介质中产生细胞外转化酶。
1.一种生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，同时或分开采用至少两种微生物或酵母，以将蔗糖转化为低聚果糖(fos)并且完全消耗介质中的葡萄糖，并在最终产品的干燥过程中蒸发酒精或乙醇，所述两种微生物或酵母中的一种微生物或酵母不能在含有蔗糖的介质中产生细胞外转化酶。
2.根据权利要求1所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，所获得的fos存在长链低聚物gf5和gf6、以及较大平均尺寸的其他短链低聚物gf2、gf3和gf4。
3.根据权利要求1所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，所述低聚果糖(fos)中包含相对于总质量为以下比率的低聚物：gf2为10％至45％、gf3为30％至55％、gf4为10％至25％、gf5为3％至13％并且gf6为0％至8％。
4.根据权利要求3所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，fos低聚物的质量相对于总质量的比例的变化范围为：gf2在15％和40％之间、gf3在35％和50％之间、gf4在13％和23％之间、gf5在3％和10％之间并且gf6在0％和6％之间。
5.根据权利要求1所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，将来自甘蔗、甜菜根、甘蔗糖浆和糖蜜的糖类用作蔗糖的来源。
6.根据权利要求1或5所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，所述介质含有20质量％至60质量％的蔗糖。
7.根据权利要求1所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，所述微生物或酵母中的一种为短梗霉属(aureobasidium sp.)。
8.根据权利要求1所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，所述微生物或酵母中的一种是经基因修饰的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。
9.根据权利要求1所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，所述经基因修饰的酿酒酵母是一种从巴西的工业糖和酒精环境中分离出来的称为pe-2的野生菌株，该菌株经历了与转化酶产生相关的基因的简单删除。
10.根据权利要求1所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，作为所述酵母的经基因修饰的酿酒酵母选择性地仅消耗葡萄糖和果糖，而不消耗蔗糖和fos，即具有α,1-2和β,2-1型键的低聚物。
11.根据权利要求8所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，基因操作已应用于9号染色体。
12.根据权利要求1所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，同时或分开采用至少两种微生物或酵母，以将蔗糖转化为低聚果糖(fos)并且完全消耗介质中的葡萄糖，并在最终产品的干燥过程中通过蒸发将酒精或乙醇蒸发出来，所述两种微生物或酵母中的一种微生物或酵母不能在含有蔗糖的介质中产生细胞外转化酶。
13.根据权利要求12所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，同时或分开采用至少两种微生物或酵母，以将蔗糖转化为低聚果糖(fos)并且完全消耗介质中的葡萄糖，并在最终产品的干燥过程中蒸发酒精或乙醇，所述两种微生物或酵母中的一种微生物或酵母不能在含有蔗糖的介质中产生细胞外转化酶。
14.根据前述权利要求中任一项所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，采用含有20质量％至60质量％的蔗糖的水性介质，其中接种短梗霉属和不能产生细胞外转化酶的经基因修饰的酿酒酵母，接种物浓度呈现为这两种酵母中每一种的最小群体数为5×107cfu/ml，在搅拌和通气条件下保持在30℃和35℃之间的温度，直到完全除去介质中存在的葡萄糖，并在最终产品的干燥过程中通过蒸发除去乙醇。
15.根据前述权利要求中任一项所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，通过以下方式制备含有所述酵母的接种物：将含有10％至20％的总还原糖(trs)的水性介质以介质:短梗霉属分别为1:10的体积比(v/v)接种短梗霉属，并且在其生长后，以相同的1:10的接种物:介质的体积比接种经基因修饰的酿酒酵母，在搅拌和通气条件下保持在32℃和35℃之间的温度，并且在这两种培养物或酵母完全生长后，将所述接种物以接种物:介质分别为1:10的体积比(v/v)转移到含有10％至20％trs的新培养基中，保持在相同的温度以及搅拌和通气条件下，直到完全生长并且每种酵母的最小种群数为5×107cfu/ml。
16.根据前述权利要求中任一项所述的生产和纯化低聚果糖的方法，其特征在于，首先制备体积为“9x”升的含有10％至20％的总还原糖(trs)的水性介质并接种体积为“1x”升的短梗霉属，生长24小时后，接种经基因修饰的酿酒酵母，使其在32℃至35℃之间的温度以及搅拌和通气条件下至少再孵育24小时，在这两种培养物完全生长后，将“10x”升的接种物培养物转移到“90x”升含有10％至20％trs(总还原糖)的培养基中，在32℃至35℃之间的受控温度以及搅拌和通气条件下孵育，直到完全生长并且每种酵母(所述短梗霉属和所述经基因修饰的酿酒酵母)的最小种群数为5×107cfu/ml；然后将所述接种物以水性介质体积的10％至20％的比率转移到总介质中含有20％至60％蔗糖的蔗糖和/或糖蜜和/或甘蔗糖浆水性介质中，其中fos的合成发生在最少12小时的时间段内，而通过所述经基因修饰的酿酒酵母消耗去除葡萄糖发生在12小时和60小时之间，这一时间段取决于介质的初始蔗糖浓度，温度在30℃至35℃之间。
17.通过根据权利要求1至16中任一项所述的方法获得的产品，其特征在于包含纯化的低聚果糖(fos)，并且最终产品中不含葡萄糖和乙醇。
18.根据权利要求17所述的产品，其特征在于，获得的低聚果糖(fos)存在长链低聚物gf5和gf6、以及较大平均尺寸的其他短链低聚物gf2、gf3和gf4。
19.根据权利要求17或18所述的产品，其特征在于，gf2的质量比为10％至45％、gf3的质量比为30％至55％、gf4的质量比为10％至25％、gf5的质量比为3％至13％并且gf6的质量比为0％至8％。
20.根据权利要求19所述的产品，其特征在于，fos低聚物的质量比的变化范围为：gf2在15％和40％之间、gf3在35％和50％之间、gf4在13％和23％之间、gf5在3％和10％之间并且gf6在0％至6％之间。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的产品，其特征在于包含低聚果糖(fos)和相对于总质量为3质量％至10质量％的本领域技术人员已知的干燥辅助添加剂。
