背景技术：
技术实现思路
1、现已发现，具有以下结构式的l-亚氨基糖(缩写为l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj)及其药学上可接受的盐表现出显著的抑制硫酸乙酰肝素蓄积的能力，因此是用于治疗黏多糖贮积症i、ii、iii或vii型及其亚型，特别是sanfilippo综合征及其a、b、c和d亚型，以及用于治疗以硫酸乙酰肝素蓄积为特征的其他病症、例如阿尔茨海默病和肿瘤的有用工具。
2、
3、d’alonzo d.等人,(2017).j.med.chem.60,9462；(2017)描述了l-nbdnj(n-丁基-l-脱氧野尻霉素，miglustat的非天然对映体)的合成；l-nbdnj已被证明是庞贝氏病的疗法的候选药物。
4、d'alonzo d.等人,(2017).j.med.chem.60,9462和de fenza m.等人,(2019).eur.j.med.chem.175,63描述了l-亚氨基糖l-dnj(脱氧野尻霉素或duvoglustat的非天然对映体)和l-ampdnm(n-金刚烷甲氧基戊基l-dnj)的合成。
5、化合物l-mondnj(n-甲氧基壬基l-dnj)是新的并且构成了本发明的另一个目的。
6、对于预期的治疗用途，亚氨基糖l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj或其药学上可接受的盐将被配制成适合于口服或肠胃外施用的药物组合物，例如胶囊、片剂、溶液等，其含有合适的赋形剂。
7、剂量将由专家根据患者的病症、体重、性别和年龄以及化合物的药代动力学和毒理学特性来确定。原则上，剂量可以与已在使用的药物(miglustat和migalastat)的剂量相似，例如每天10至1000mg，一次或多次施用。
8、与其他结构相似的亚氨基糖(化合物l-nndnj、l-hpdnj和l-npdnj，其分子式如下所示)相比，所观察到的化合物l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj或其药学上可接受的盐药理活性非常有趣，在相同条件下评估时这些亚氨基糖未显示任何活性。
9、根据本发明化合物和比较化合物的结构式报告如下。
10、
11、在以下实验部分中详细描述了本发明。
12、实施例1：l-mondnj(n-甲氧基壬基l-dnj)及其相应的盐酸盐衍生物的合成。
13、步骤a：1,9-二碘壬烷(diiodiononane)的合成。在氩气气氛下，将碘(2.6g，10.2mmol)加入到聚合物三苯基膦(ps-tpp；100-200目，～3mmol/g三苯基膦)(3.4g，10.5mmol)在无水二氯甲烷(25ml)中的搅拌悬浮液中。10分钟后，将1,9-壬二醇加入至悬浮液(0.41g，2.56mmol)中，在室温下搅拌反应1小时。随后过滤悬浮液，通过用二氯甲烷洗涤，以除去附着聚合物(polymer-anchored)的三苯基氧膦。用饱和na2s2o3和饱和nacl溶液洗涤滤液，并用二氯甲烷萃取。
14、将有机相干燥(na2so4)并在减压下蒸发，得到所需的1,9-二碘壬烷(油状物，0.9g，95％收率)。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ1.21-1.47(m,10h),1.76-1.88(m,4h),3.19(t,j＝7.0hz,4h)。在此反应中，用三苯基膦代替聚合三苯基膦在反应时间和收率方面得到类似的结果；然而，此过程需要通过沉淀三苯基氧膦或通过色谱法进行纯化步骤。
15、步骤b：1-碘-9-甲氧基壬烷的合成。在0℃和氩气气氛下，在磁力搅拌下将nah(60％分散体，在矿物油中，0.10g，2.55mmol)加入到甲醇(0.12ml，2.95mmol)在干燥thf(3.5ml)中的溶液中。将反应混合物在相同温度下搅拌1小时；然后，加入1,9-二碘壬烷(0.75g，1.95mmol)在thf(3.5ml)中的溶液。将溶液温至室温并在相同温度下搅拌48小时。随后，加入二氯甲烷，并先用nh4cl水溶液洗涤溶液，然后用饱和nacl溶液洗涤。用na2so4干燥有机相，并在减压下蒸发溶剂。硅胶上进行的粗残余物的色谱法(己烷：etoac＝95:5)得到纯的1-碘-9-甲氧基壬烷(油状物，0.42g，收率75％)。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ1.21-1.47(m,8h),1.51-1.63(m,4h),1.76-1.88(m,2h),3.19(t,j＝7.0hz,2h),3.30(s,3h),3.36(t,j＝6.6hz,2h)。
16、步骤c：l-mondnj(n-甲氧基壬基l-dnj)的合成。在室温、氩气氛围下，在磁力搅拌下，向l-dnj(0.20g，1.22mmol)在干燥dmf(4ml)中的溶液中加入k2co3(0.5g，3.6mmol)。逐滴加入1-碘-9-甲氧基壬烷(0.42g，1.46mmol)在dmf(4.0ml)中的溶液，并将反应混合物加热至80℃并搅拌16小时。在减压下除去溶剂，并在硅胶上进行色谱法(丙酮：meoh＝8:2)，得到纯l-mondnj。
17、步骤d：l-mondnj·hcl(n-甲氧基壬基l-dnj·hcl)的制备。通过添加1mhcl(1.22mmol)，随后在减压下蒸发，得到l-mondnjhcl盐酸盐(0.30g，收率75％)。1h nmr(500mhz,cd3od):δ1.28-1.49(m,10h),1.52-1.63(m,2h),1.67-1.88(m,2h),2.95-3.11(m,2h),3.13-3.27(m,1h),3.31(s,3h),3.40(t,j＝6.5hz,4h),3.47(dd,j＝4.9,11.8hz,1h),3.61(t,j＝11.8hz,1h),3.65-3.77(m,1h),3.91(d,j＝11.6hz,1h),4.14(d,j＝11.6hz,1h)。
18、实施例2：用l-脱氧氨基糖(l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj)的盐酸盐处理可减少sanfilippo b疾病(mps iiib)细胞模型中的溶酶体缺陷。
19、为了研究这些化合物对sanfilippo b疾病(mps iiib)神经元模型中溶酶体功能障碍的影响，我们最近生成了人神经母细胞瘤细胞系sk-nbe的稳定克隆，该细胞系sk-nbe沉默了引起mps iiib的naglu基因[de pasquale v,et al.(2021).biochim biophys actamol cell res.1868,119113.]。模拟sanfilippo b疾病的特征，沉默naglu导致稳定的sk-nbe克隆的细胞质中硫酸乙酰肝素蓄积和溶酶体蓄积(与对照(wt)克隆相比)。
20、因此，选择naglu沉默克隆(cl5)和对照克隆(wt)来测试盐酸盐形式的l-脱氧氨基糖(l-dnj、l-nbdnj、l-nndnj、l-hpdnj、l-npdnj、l-ampdnm和l-mondnj)对我们的sanfilippo b(mps iiib)细胞模型溶酶体表型的影响。
21、在正常生长条件下，将克隆5在20μm每种l-脱氧氨基糖的存在下培养，并在48小时后通过使用针对lamp1(溶酶体标记物)的特异性抗体，用免疫荧光技术评估溶酶体的蓄积。与wt对照克隆相比，未经处理的克隆5显示出在细胞质内增大的阳性lamp1溶酶体结构(表1)。用l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj处理可显著减少sanfilippo b(mps iiib)的克隆5(cl5)模型体系中的溶酶体增大和蓄积(表1)。此外，在用活性l-脱氧氨基糖处理后，溶酶体不再像在几种溶酶体疾病中发生的那样集中在细胞的核周区域，而是生理性地分布在整个细胞质中。有趣的是，l-脱氧氨基糖l-nndnj、l-hpdnj和l-npdnj对sanfilippo b模型克隆5(cl5)的溶酶体表型没有表现出任何活性(表1)。
22、表1
23、
24、将这些结果与wt对照正常克隆中lamp1蛋白的免疫荧光获得的结果进行比较，l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj处理的细胞中的溶酶体在细胞质内的生理分布更加明显。
25、使用七种l-亚氨基糖中的任何一种进行处理都不会导致非病变的wt模型细胞中溶酶体的大小和分布发生任何变化。
26、总体而言，这些结果首次表明，使用所选的l-亚氨基糖(l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj)处理能够减少sanfilippo b病(mps iiib)细胞模型中的溶酶体缺陷。
27、实施例3：用l-脱氧氨基糖(l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj)的盐酸盐处理可减少sanfilippo b疾病(mps iiib)细胞模型中的hs蓄积。
28、在正常生长条件下，克隆5在20μm每种l-亚氨基糖的存在下生长，并在48小时后通过对hs的免疫荧光染色评估硫酸乙酰肝素(hs)的蓄积。与wt对照克隆相比，未经处理的克隆5显示出hs在细胞膜上的蓄积(表2)。然而，在化合物l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj的存在下，在sanfilippo b模型体系(mps iii b)cl5中观察到hs染色急剧减少(表2)。同样在这种情况下，l-亚氨基糖l-nndnj、l-hpdnj和l-npdnj在测试的sanfilippo b模型中没有表现出任何hs蓄积减少的活性(表2)。这些结果与使用溶酶体的lamp1染色所获得的结果一致。
29、表2
30、
31、此外，用七种l-亚氨基糖中的任何一种进行处理都不会导致非病变的wt模型细胞中hs的量发生变化。
32、总体而言，这些结果首次表明，使用所选的l-亚氨基糖l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj处理能够减少我们实验室生成的sanfilippo b病(mps iiib)细胞模型中的hs蓄积。
33、实施例4：用l-脱氧氨基糖(l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj)的盐酸盐处理可减少受sanfilippo a和b(mps iiia和iiib)影响的患者的成纤维细胞中的溶酶体缺陷和hs蓄积。
34、为了验证所选的亚氨基糖是否也能对受sanfilippo疾病影响的患者的成纤维细胞发挥同样的作用，使用人类成人真皮成纤维细胞hdfa(购买自sigma-aldrich)作为对照，并使用受sanfilippo a和b(mps iiia和iiib)影响的患者的成纤维细胞作为疾病模型。
35、实施例中使用的mps(sanfilippo疾病)患者的人类细胞系成纤维细胞获自热那亚的g.gaslini研究所，"受遗传病影响的患者的细胞系和dna生物库"-telethon遗传生物库网络-telethon研究服务。这些细胞根据识别码和疾病类型进行分类，而不识别患者。在gaslini研究所收集患者的细胞，并在知情同意的情况下将采集物扩展到保存及其可能的用途，用于诊断和/或研究目的，根据telethon生物库遵循(followed by)的指导方针所要求的现行法规。该网络遵守现行的意大利隐私和数据保护法，包括：意大利数据保护局，个人数据保护法，第196号立法法令，2003年6月30日，发表于2003年7月29日意大利共和国第174号官方公报；意大利数据保护局，遗传数据处理的一般授权，2011年6月24日，发表于2011年7月11日意大利共和国官方公报第159号。
36、细胞在所选的l-亚氨基糖(剂量为20μm)的存在下进行培养，并在48小时后进行hs和lamp1免疫荧光处理。用l-亚氨基糖处理对对照hdfa没有影响(表3)。另一方面，相同的l-亚氨基糖l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj引起受sanfilippo a和b(mps iiia和mpsiiib)影响的患者的成纤维细胞中hs和溶酶体蓄积的强烈降低(表3)。
37、表3
38、
39、同样在这种情况下，l-亚氨基糖l-nndnj、l-hpdnj和l-npdnj没有表现出对sanfilippo a和b患者的成纤维细胞中的hs和lamp1蓄积的降低的任何活性(表3)。
40、总体而言，这些结果首次表明，使用所选的l-亚氨基糖l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj处理能够预防受sanfilippo a和b疾病影响的患者的成纤维细胞中的hs和溶酶体的蓄积。
41、实施例5：用d-脱氧氨基糖(d-dnj或dnj，d-nbdnj或nbdnj或d-ampdnm或ampdnm，或d-ampdnm或ampdnm，或d-mondnj或mondnj)的盐酸盐处理对受sanfilippo a和b(mps iiia和iiib)影响的患者的成纤维细胞中的溶酶体缺陷和hs蓄积没有影响。
42、为了证明目前可用于治疗其他溶酶体疾病的亚氨基糖(d-dnj，也称为duvoglustat，以及d-nbdnj也称为miglustat)以及立体异构体d-ampdnm和d-mondnj不具有与本发明化合物相同的功效，使用成人真皮成纤维细胞hdfa作为对照(购自sigma)，并使用sanfilippo a和b患者的成纤维细胞(mps iiia和iiib)作为疾病模型。细胞在20μm剂量的亚氨基糖d-dnj、d-nbdnj、d-ampdnm和d-mondnj存在下生长，并在48小时后进行hs和lamp1免疫荧光处理。使用d-亚氨基糖处理对受sanfilippo a和b(mps iiia和mps iiib)影响的患者的hdfa和成纤维细胞均无影响，无论是对hs还是溶酶体蓄积(表4)。
43、表4
44、
45、总体而言，这些结果表明了所选的l-亚氨基糖l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj在预防受sanfilippo a和b影响的患者的黏多糖贮积症细胞模型(例如成纤维细胞)中hs和溶酶体的蓄积的功效。
46、实施例6：用盐酸盐形式的l-脱氧氨基糖(l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj)处理可引发hela肿瘤上皮细胞系中hs含量的降低及其生长的减少。
47、为了测试使用所选的l-脱氧氨基糖(l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj)处理是否会干扰hs合成，我们选择了未发生naglu突变且细胞膜上硫酸乙酰肝素高度修饰的细胞系。为了该目的，将hela肿瘤上皮细胞(购自atcc)在所选的l-亚氨基糖存在下培养48小时，并通过免疫染色评估hs的量。用相同的l-亚氨基糖l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj处理引起hela细胞膜上的hs蓄积强烈减少(表5)。
48、表5
49、
50、同样在这种情况下，l-亚氨基糖l-nndnj、l-hpdnj和l-npdnj没有表现出对hela肿瘤上皮细胞中的hs蓄积减少的任何活性(表5)。
51、此外，如表6报告的细胞增殖测定所示，用l-脱氧氨基糖l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj处理48小时后，引起hela细胞数量减少。
52、表6
53、
54、该结果表明，用l-dnj l-亚氨基糖、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj处理会引起hela癌细胞中的hs的减少，随后抑制肿瘤细胞生长，因为hs对于维持癌症上皮细胞的增殖至关重要。
55、表6报告的数据还证明，与本发明的化合物相比，属于d系列的亚氨基糖，d-dnj或duvoglustat、d-nbdnj或miglustat、d-ampdnm和d-mondnj在降低癌细胞增殖方面不具有相同的功效。
56、这些数据表明，与其他市售亚氨基糖的作用机制相比，l-亚氨基糖以一种全新的机制干扰hs合成。此外，这些结果表明，本发明不仅可应用于存在hs蓄积的黏多糖贮积症，还可应用于癌症疾病，其中hs对支持肿瘤细胞生长及其转移机制至关重要。
57、实施例7：用盐酸盐形式的l-脱氧氨基糖(l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj)处理可引发sanfilippo b疾病(mps iiib)细胞模型中淀粉样β纤维的量减少。
58、为了证明所选的亚氨基糖l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj对神经退行性疾病的治疗应用，我们使用了我们实验室最近生成的sanfilippo b(cl5)神经元模型(实施例2)。
59、克隆(cl5)稳定沉默naglu(mps iiib的致病基因)能够模仿神经退行性疾病的特征，因为它会在细胞质中蓄积β-淀粉样纤维。事实上，sanfilippo综合征也被定义为“儿童阿尔茨海默病”。
60、患病克隆(cl5)在剂量为20μm的l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj以及相应的对映体d-dnj、d-nbdnj、d-ampdnm和d-mondnj存在下生长，并在48小时后通过针对β-淀粉样肽1-42的免疫荧光处理。表7中报告的数据表明，与未处理的细胞(模拟物)相比，用l-脱氧氨基糖处理导致淀粉样纤维的蓄积总体减少。相反，与未处理的克隆(模拟物)相比，用相应的d-对映体处理对淀粉样纤维蓄积的减少没有影响(表7)。
61、表7
62、
63、这些结果首次表明，权利要求中的l-亚氨基糖l-dnj、l-nbdnj、l-ampdnm和l-mondnj可有效减少淀粉样斑块的蓄积并治疗神经退行性过程如阿尔茨海默病。表7中报告的数据还表明，与本发明化合物不同，d-亚氨基糖d-dnj、d-nbdnj、d-ampdnm和d-mondnj在减少神经退行性标志物方面不具有相同的功效。
1.下式的亚氨基糖或其药学上可接受的盐：
2.用于根据权利要求1所述的使用的亚氨基糖，其中硫酸乙酰肝素贮积疾病是黏多糖贮积症i、ii、iii或vii型。
3.用于根据权利要求2所述的使用的亚氨基糖，其中所述疾病是sanfilippo综合征及其亚型(a、b、c、d)。
4.用于根据权利要求2所述的使用的亚氨基糖，其中所述疾病是阿尔茨海默病。
5.用于根据权利要求2所述的使用的亚氨基糖，其中所述疾病是肿瘤。
6.下式的化合物及其药学上可接受的盐：
