本发明涉及属于c型凝集素(clec)类别的多糖佐剂。
背景技术：
1、疫苗接种被认为是挽救生命和减轻疾病负担的最有效手段之一。通过主动免疫，疫苗被接种，致使宿主的免疫系统产生非特异性先天免疫应答以及可针对所用免疫原而起作用的特异性抗体、b和t记忆细胞。
2、多糖是重要的毒力因子，尤其是对于表面呈现复杂碳水化合物结构的荚膜细菌而言。细菌、真菌或其他多糖由重复的单糖单元构成，这些单糖单元通过糖苷键连接，形成线性或分支的聚合结构。众所周知，对各种细菌多糖的抗体应答较弱，并且由于它们不会诱发免疫记忆，因此不会因后续免疫而增强。
3、这些特征是基于多糖的性质：与蛋白质不同，多糖构成t细胞非依赖性(ti)抗原。多糖抗原直接激活多糖特异性b细胞，这些b细胞然后分化为浆细胞以产生抗体。不形成记忆b细胞。蛋白质和肽是t细胞依赖性(td)抗原；在与抗原呈递细胞(apc)如树突细胞(dc)、巨噬细胞和b细胞相互作用后，蛋白质抗原被内化并加工成小肽，这些小肽然后与主要组织相容性复合体(mhc)ii类分子一起被重新暴露并被呈递给t淋巴细胞。与t细胞的相互作用会诱导b细胞分化为浆细胞和记忆b细胞。与ti抗原不同，td抗原具有免疫原性，可通过佐剂来增强和促进应答(peltola et al.pediatrics november 1977,60(5)730-737,guttormsen hk et al.infection和immunity,may 1998,p.2026–2032和infection和immunity,dec.1999,p.6375–6384,avci et al.nature medicine volume 17,pages1602–1609(2011))。
4、纯多糖疫苗的局限已通过将多糖与载体蛋白共价偶联作为t细胞表位的来源而被克服。这一概念已成功应用于目前市场上的数种糖偶联物疫苗，这些疫苗被开发为针对细菌病原体，例如脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌b和b族链球菌。所有这些疫苗都使用病原体特异性碳水化合物来诱导碳水化合物特异性抗体作为主要保护因子。
5、众所周知，来自植物、细菌、真菌和合成来源的碳水化合物基多糖可以充当所谓的病原体相关分子模式(pamp)。与免疫系统接触后，pamp会被特化的免疫细胞上的模式识别受体(prr)识别。
6、prr是一类生殖系编码受体，其结合/激活后对于启动先天免疫至关重要，在形成更特异性的适应性免疫之前，它在第一道防线中发挥着关键作用。先天免疫应答是抵御传染病和组织损伤的第一道防线。特化的细胞(主要是apc，如巨噬细胞和树突细胞)以及一些非特化细胞(如上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞)都表达这些prr，并在先天免疫应答期间的病原体识别中发挥主要作用。此外，先天免疫信号激活apc是产生强大适应性免疫(包括抗体应答和记忆应答)的关键先决条件。
7、目前已鉴定的prr家族分为跨膜受体和细胞内受体。跨膜受体包括toll样受体(tlr 1-9)和c型凝集素受体(clr)，细胞内受体包括核苷酸结合型寡聚化结构域(nod)样受体(nlr)、视黄酸可诱导的基因-(rig-)i样受体(rlr)和aim2样受体(alr)。
8、碳水化合物尤其多糖的pamp特性导致有各种方法来开发多糖作为成功的疫苗佐剂。
9、一个突出的例子是菊粉(inulin)，一种在菊科植物根部发现的多糖。它由线性β-d-(2,1)多聚呋喃果糖基α-d-葡萄糖组成，其中多达100个果糖部分与单个末端葡萄糖相连。菊粉在其天然可溶形式下没有免疫活性，但当结晶成不同的稳定微晶颗粒(菊粉α-δ)时，获得强效佐剂活性，可为蛋白质偶联疫苗所用。δ菊粉颗粒的上市产品是advaxtm佐剂，其显示出一致的球晶样盘状颗粒，直径1-2μm，由一系列层状片组成。δ-和γ-菊粉被认为通过替代型补体激活起作用，因为已证明γ菊粉的佐剂作用机制涉及增加巨噬细胞表面的c3沉积，从而增强t细胞活化(kerekes et al.j leukoc biol.2001jan；69(1):69-74)。
10、另一类多糖基佐剂候选物是壳聚糖基佐剂。壳聚糖是d-葡糖胺和n-乙酰-d-葡糖胺(glcnac)的线性β-(1,4)连接共聚物，通过对几丁质进行部分碱性脱乙酰化而制得。可溶性壳聚糖本身的免疫原性也很差。然而，配制为干粉颗粒或配制在溶液中的壳聚糖已被广泛用作粘膜和全身疫苗递送的包封剂，也用于制备粘膜dna疫苗。它用于粘膜疫苗递送，因为它促进吸收和随后的吞噬作用，从而增强粘膜免疫应答(dodane et al.internationaljournal of pharmaceutics 182(1999)21–32,seferian et al.vaccine 19(2001)661–668)。壳聚糖颗粒的粘膜粘附特性归因于其阳离子特性。
11、体外试验表明，与可溶性抗原相比，壳聚糖颗粒中包裹的牛血清白蛋白(bsa)或卵清蛋白(ova)可以更有效地刺激raw264.7巨噬细胞和bmdc活化(koppolu b,et al.theeffect of antigen encapsulation in chitosan particles on uptake,activation和presentation by antigen presenting cells.biomaterials.2013；34:2359-2369)。
12、neimert-andersson等使用了viscogel，一种可溶性壳聚糖水凝胶。viscogel与针对b型流感嗜血杆菌(act-hib)的疫苗一起使用，可以作为无佐剂疫苗，诱导针对这些抗原的更强体液应答和细胞应答。血清中的igg1和igg2a滴度显著增强。th1、th2和th17型细胞因子的生成也增加了。不幸的是，viscogel被证明不适合人类使用(vaccine.2014；32:5967-5974)。
13、几丁质和壳聚糖颗粒都很容易被吞噬，支持通过特异性受体介导的吞噬作用进行识别。髓系细胞上与几丁质或壳聚糖结合并诱导吞噬反应的受体尚未确定。迄今，已有数种受体被显示与几丁质或几丁质寡糖结合，包括：fibcd1，一种在胃肠道表达的同型四聚体55kda ii型跨膜蛋白；nkr-p1，大鼠自然杀伤细胞上的激活受体；regiiic，一种分泌的c型凝集素；以及半乳糖凝集素-3，一种对β-半乳糖苷具有亲和力的凝集素。甘露糖受体也显示与glcnac结合，因此是基于壳聚糖的疫苗偶联物的潜在受体。据报道，viscogel以与几丁质类似的方式触发免疫应答，因为据报道几丁质颗粒可作为pamp发挥作用并识别巨噬细胞上的tlr-2受体以诱导先天免疫应答。
14、yu等(mol.pharmaceutics,2016,doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00138)还证明，菊粉-壳聚糖与结核分枝杆菌cfp10-tb10.4融合蛋白(ct)的偶联物与未加佐剂的蛋白相比，流体动力学体积显著增加，并且这种疫苗激发高水平的th1型(ifn-γ、tnf-α和il-2)和th2型细胞因子(il-4)以及有效的ct-特异性抗体滴度，主要为igg1和igg2b。药代动力学研究表明，菊粉-壳聚糖偶联物可延长ct在血清中暴露给免疫系统的时间(mol.pharmaceutics 2016,13,11,3626–3635)。
15、用作佐剂的最突出的多糖类别之一是c型凝集素(clec)类，它们与其受体相互作用，所述受体被称为c型凝集素受体(clr)。clr被视为ca2+依赖性碳水化合物识别蛋白。这些受体在其c型凝集素样结构域(clecd)上表达单个或多个碳水化合物识别结构域(crd)，这些结构域是结合clec所必需。clr家族的成分与不同的碳水化合物(例如甘露糖、岩藻糖、葡萄糖、麦芽糖、n-乙酰-d-葡糖胺或其他聚糖和葡聚糖)结合。
16、clr分为跨膜clr(tm-clr)和可溶性clr(胶原凝集素(collectins))。tm-clr进一步分为i型tm-clr和ii型tm-clr。i型tm-clr包括甘露糖受体(mr)和endo180[甘露糖受体c型2(mrc 2)]受体，与甘露糖、岩藻糖和n-乙酰葡糖胺结合。ii型tm-clr包括树突细胞特异性细胞内粘附分子-3抓取性非整合素(dc-sign)、langerin、和巨噬细胞半乳糖型凝集素(mgl)受体。已知dc-sign结合n连接型聚糖(支链三甘露糖结构)，例如hiv-i糖蛋白gp120和其他病毒(如丙型肝炎病毒、人类巨细胞病毒、登革热病毒或埃博拉病毒)上的聚糖。dc-sign还识别脂阿拉伯甘露聚糖和甘露聚糖。langerin是与朗格汉细胞(lc)相关lr，其结合含有甘露糖和岩藻糖的聚糖残基。mgl对末端n-乙酰半乳糖胺(galnac)残基有结合特异性，还显示对空肠弯曲菌和肿瘤相关粘蛋白muc1具有亲和力，它参与控制效应t细胞的适应性免疫。此外，巨噬细胞可诱导的c型凝集素(mincle，也称clec4a)以及dectin-1/dectin-2受体家族已有报道。dectin-1在介导抗真菌的先天免疫中起着重要作用，能与真菌(例如：酿酒酵母β-葡聚糖)、地衣(例如：石耳聚糖、地衣聚糖)、藻类(例如：laminarin)或大麦和其他谷物品种中的β-葡聚糖结合。dectin-2含有epn(glu-pro-asn)氨基酸基序，可为甘露糖配体提供敏感性。此外，dectin-2还与白色念珠菌相互作用。
17、将抗原靶向抗原呈递细胞(apc)上的内吞受体是增强疫苗效力的一种有吸引力的方法。具体地，甘露糖受体(mr)和相关的c型凝集素受体(clr)家族成员，例如dec205、dc-sign、mgl、langerin、dectin-1和mincle，表现出出色的碳水化合物抗原捕获和处理能力。
18、尤其是未成熟的树突细胞(dc)表达大量clr，与其感知和捕获自身和非自身抗原、以处理和呈递到mhc分子上、从而诱导抗原特异性t细胞活化的重要功能相关。因此，它们将先天性和适应性免疫应答联系起来。
19、clec已被用作免疫应答的非特异性刺激剂和免疫佐剂。例如，vojtek等(food和agricultural immunology,2017,28:6,993-1002)可以证明，口服β-(1,3)、β-(1,6)葡聚糖与在狗中针对狂犬病病毒和犬细小病毒2的免疫接种相结合，导致更早形成针对这两种病毒的保护水平的抗体。
20、多项研究表明，apc的激活状态在诱导的免疫类型中起主导作用。例如，在炎症条件下用抗原抗体偶联物进行免疫接种导致th1应答，无论抗原是靶向clr dec-205、langerin、clec9a、或ig超家族成员treml4都如此。
21、相反，在非炎症(稳态)条件下进行免疫接种会导致耐受的诱导。langerin+迁移性dc(而非淋巴结驻留性dc)已被鉴定为主要的treg诱导剂，与树突细胞的来源(皮肤或肺)或被靶向的受体无关。
22、特别是利用甘露聚糖作为clec来靶向甘露糖受体(mr)或其他甘露聚糖感应性clr，已被证明能有效诱导细胞-和体液-免疫应答；因此，mr-和其他clr-靶向疫苗在治疗癌症、传染病以及诱导自身免疫病的特异性耐受方面受到了越来越多的关注。
23、甘露聚糖是一种来源于酵母细胞壁的多糖，其骨架主要由β-(1,4)-连接的甘露糖和少量α-(1,6)-连接的葡萄糖和半乳糖侧链残基组成。此外，在常规甘露聚糖制剂中检测到的蛋白质含量约为5％。作为真菌细胞壁的重要组成部分，甘露聚糖已被广泛用作念珠菌病碳水化合物基疫苗的成分(han和rhew,arch pharm res 2012,vol 35,no 11,2021-2027；cassone,nat rev microbiol.2013dec；11(12):884-91；johnson和bundle,chem.soc.rev.,2013,42,4327)。此外，已开发出基于甘露聚糖载体-抗原复合物/偶联物的疫苗的不同实例，包括甘露聚糖-粘蛋白1(muc1)融合蛋白偶联用于肿瘤疗法，或甘露聚糖与模型过敏原(如卵清蛋白(ova)、木瓜蛋白酶papain或betv1)的偶联物。
24、粘蛋白(mucin)是细胞表面表达的高度糖基化蛋白。muc1是一种原型粘蛋白，已发现其在广泛多种肿瘤细胞上过度表达。沿着这些思路，制成一种含有5个串联重复的人muc1(含免疫显性表位：apdtrpapgstappahgvts)和肽(cpl3-32)的muc1融合蛋白，并在氧化或还原条件下与甘露聚糖偶联，导致截然不同的免疫应答：氧化的甘露聚糖-muc1刺激由cd8+t细胞介导的th1型应答，有ifn-γ分泌，且主要是igg2a抗体应答，而还原的甘露聚糖-muc1刺激th2型应答，有il-4生成和高水平igg1抗体应答。所用的融合蛋白代表一种展示t细胞和b细胞表位的单个蛋白。
25、最近还生成了木瓜蛋白酶和ova的蛋白质-碳水化合物/甘露聚糖复合物，以分析其致敏潜力。研究发现，将甘露聚糖偶联到蛋白质表面可以降低抗木瓜蛋白酶的ige抗体的结合和交联。有趣的是，在这些实验中，甘露聚糖、葡聚糖或麦芽糊精的偶联只会降低木瓜蛋白酶的致敏潜力，而不会降低ova的致敏潜力，这表明碳水化合物的选择对于疫苗设计的重要性(weinberger et al.j.control.release 2013；165:101–109)。这些实验还表明，甘露聚糖偶联导致在皮内免疫接种后生成升高的抗ovaigg滴度。
26、与新糖偶联物疫苗用于muc1类似，ghochikyan等(dna和cell biology,volume25,number 10,2006,571-580)和petrushina等(journal of neuroinflammation 2008,5:42)采用淀粉样蛋白β(aβ)28(一种28个aa残基的肽，携带人aβ42肽的b细胞表位和t细胞表位的组合)与甘露聚糖偶联，可在小鼠中诱导低水平的抗aβ应答。这些应答还被证明，在给app转基因小鼠皮下免疫接种后，可减轻皮质区和海马区的淀粉样蛋白沉积。免疫接种还导致在aβ28-甘露聚糖和bsa-甘露聚糖处理过的动物体内诱导了增加的抗甘露聚糖滴度。然而，所述处理未能进一步发展，很可能是因为处理过的动物脑部出现增加的微出血，这被归因于甘露聚糖的潜在有害影响，因为它会引发不良的血管事件，这强调了碳水化合物的选择对于设计有效且安全的疫苗的重要性。
27、迄今尚不知有单个b细胞表位肽或t细胞表位肽与甘露聚糖或其他相关clec偶联的偶联物。
28、β-葡聚糖包含一组β-d-葡萄糖多糖。这些多糖是真菌细胞壁的主要结构成分，也见于细菌、酵母、藻类、地衣、以及诸如燕麦和大麦等植物中。根据来源不同，β-葡聚糖的连接类型、分支程度、分子量和三级结构也不同。
29、β-葡聚糖是可溶性、可发酵纤维(也称益生元纤维)的一个来源，它提供大肠内微生物群的底物，增加粪便体积，产生具有广泛生理活性的副产品短链脂肪酸。例如，血液胆固醇水平正常或升高的人每天摄入至少3克来自燕麦的谷物型β-葡聚糖，可使总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平降低5～10％。
30、通常，β-葡聚糖形成具有1-3个β-糖苷键的线性骨架，但分子量、溶解度、粘度、分支结构、和凝胶特性各不相同。酵母和真菌β-葡聚糖通常建立在β-(1,3)骨架上，并含有β-(1,6)侧支，而谷物β-葡聚糖包含β-(1,3)和β-(1,4)两种骨架键，有或没有侧支。
31、β-葡聚糖被先天免疫系统识别为病原体相关分子模式(pamp)。prr dectin-1已成为这些碳水化合物的主要受体，β-葡聚糖与dectin-1结合，诱导经由syk/card9信号通路的多种细胞应答，包括吞噬作用、呼吸爆发和细胞因子分泌。此外，补体受体3(cr3、cd11b/cd18)也被认为是β-葡聚糖的受体。据报道，经由dectin-1的刺激会引发th1、th17和细胞毒性t淋巴细胞的应答。
32、β-葡聚糖家族的成员包括：
33、β-葡聚糖肽(bgp)是一种从真菌trametes versicolor(杂色栓菌)中提取的高分子量(～100kda)支链多糖。bgp由高度分支的葡聚糖部分组成，包含β-(1,4)骨架和β-(1,3)侧链，其中β-(1,6)侧链共价连接到富含天冬氨酸、谷氨酸和其他氨基酸的多肽部分。
34、卡德兰胶(curdlan)是一种来自agrobacterium spp.(农杆菌)的由β-(1,3)连接的葡萄糖残基组成的高分子量线性聚合物。
35、laminarin来自褐藻laminaria digitata(掌状海带)，是一种具有β-(1,6)键的线性β-(1,3)-葡聚糖。laminarin是一种低分子量(5-7kda)水溶性β-葡聚糖，可作为dectin-1拮抗剂或激动剂。它可与dectin-1结合而不刺激下游信号传导，并能阻断dectin-1与粒状β-(1,3)-葡聚糖(如zymosan)的结合。
36、石耳聚糖(pustulan)是一种中等分子量(20kda)线性β-(1,6)连接型β-d-葡聚糖，来自地衣lasallia pustulata，它也能作为主要受体与dectin-1结合并通过dectin-1激活信号传导。
37、地衣聚糖(lichenan)是一种高分子量(约22-245kda)线性β-(1,3)β-(1,4)-β-d葡聚糖，来自cetraria islandica(冰岛地衣)，结构类似于大麦和燕麦的β-葡聚糖。地衣聚糖的1,3-相比1,4-β-d键合比例比其他两种葡聚糖高得多。β-(1,4)-相比β-(1,3)-β-d键合比例约为2:1。
38、来自燕麦和大麦的β-葡聚糖是线性的β-(1,3)β-(1,4)-β-d葡聚糖，市场上有不同分子量的产品(中等分子量级分为35.6kda，高分子量级分高达650kda)。
39、裂褶多糖(schizophyllan,spg)是一种来自schizophyllm commune(裂褶菌)的凝胶形成型β-葡聚糖。spg是一种高分子量(450kda)β-(1,3)-d-葡聚糖，骨架上每三个β-(1,3)-葡萄糖基残基有一个β-(1,6)单葡萄糖基分支。
40、硬葡聚糖(scleroglucan)是一种高分子量(>1000kda)多糖，由丝状真菌sclerotium rolfsii发酵产生。scleroglucan由线性β-(1,3)d-葡萄糖骨架、以及每三个主要残基一个β-(1,6)d-葡萄糖侧链组成。
41、全葡聚糖颗粒(wgp)是β-葡聚糖，以其调节免疫应答的能力而著称。wgp分散剂(dispersible,biothera)是一种酿酒酵母β-葡聚糖的粒状制剂。它由中空酵母细胞壁“幽灵”组成，主要包含从酿酒酵母细胞壁经过一系列碱和酸提取后获得的β-(1,3)葡萄糖的长聚合物。与其他dectin-1配体(如zymosan)相比，wgp分散剂缺乏tlr刺激活性。相反，可溶性wgp结合dectin-1不激活该受体。并且它可以显著阻断wgp分散剂与巨噬细胞的结合及其免疫刺激作用。
42、zymosan(酵母多糖)是酵母细胞的一种不溶性制剂，可借tlr2激活巨噬细胞。tlr2与tlr6和cd14协作以响应zymosan。zymosan还被dectin-1(一种在巨噬细胞和树突细胞上表达的吞噬受体)识别，它与tlr2和tlr6协作，增强由每种受体识别zymosan所引发的免疫应答。
43、作为真菌细胞壁的主要成分，不同的β-葡聚糖已被用作抗原来产生针对真菌感染的抗葡聚糖抗体(例如：torosantucci et al.j exp med.2005sep 5；202(5):597-606.,bromuro et al.,vaccine 28(2010)2615–2623,liao et al.,bioconjug chem.2015mar18；26(3):466-76)。
44、torosantucci等(2005)和bromuro等(2010)公开了支链β-葡聚糖laminarin和线性β-葡聚糖卡德兰胶与白喉类毒素crm197的偶联物。这些偶联疫苗诱导了针对β-葡聚糖的高igg滴度，并赋予小鼠对抗真菌感染的保护作用。此外，使用此类偶联物还可以检测到抗crm197的高滴度(donadei et al.,mol pharm.2015may 4；12(5):1662-72)。这些作者还生成了β-葡聚糖-crm197疫苗，其具有合成的线性β-(1,3)-寡糖或β-(1,6)-支链β-(1,3)-寡糖，配以人类可接受的佐剂mf59。所有偶联物均诱导高滴度的抗β-(1,3)-葡聚糖igg和/或还有抗β-(1,6)-葡聚糖抗体，以及抗β-(1,3)-葡聚糖igg，表明不同葡聚糖与传统载体蛋白组合的免疫原性。有趣的是，torosantucci等在用crm-葡聚糖偶联物进行免疫后，未能证明比单独的非偶联crm更高的抗crm滴度。
45、donadei等(2015)还分析了白喉类毒素crm197与线性β-(1,3)葡聚糖curdlan或合成性β-(1,3)寡糖的偶联物。这些偶联物具有免疫原性，产生相当的抗crm197抗体应答。有趣的是，这些作者表明，crm curdlan偶联物皮内注射产生的抗体滴度比肌肉内(im)免疫的高。然而，与皮下应用相比，皮内应用crm-curdlan未显示出不同的免疫原性。此外，crm-curdlan和非curdlan偶联的crm(以alum为佐剂)的体内效果相当。因此，在此系统中未检测到clec偶联对整体免疫应答的叠加益处。
46、liao等(2015)披露了一系列线性β-(1,3)-β-葡聚糖寡糖(六、八、十和十二-β-葡聚糖)，都与klh偶联生成糖偶联物。这些偶联物被证实引发强烈的t细胞应答，且具有高度免疫原性，诱导高水平的抗葡聚糖抗体。用此类疫苗免疫的小鼠也引发了针对致命病原体白色念珠菌的保护性免疫应答。未比较抗klh滴度与非偶联的klh，因此该实验体系中没有关于β-葡聚糖潜在益处的信息。
47、这些发现对于葡聚糖基新糖偶联物作为新型疫苗的适用性非常重要：初始葡聚糖偶联物免疫接种诱发的潜在抗葡聚糖抗体，可导致随后加强免疫中相同的β-葡聚糖疫苗迅速消失，或可减弱针对其他适应症的新糖偶联物疫苗的免疫应答，这是众所周知的载体疫苗效应。高水平抗葡聚糖抗体的存在或甚至(再)刺激，如上文关于甘露聚糖和β-葡聚糖所证实的(petrushina et al.2008,torosantucci et al.2005,bromuro et al.,2010,liaoet al.,2015)，可因此减少或消除偶联物疫苗引起的潜在免疫反应。因此，对于利用clec(尤其是β-葡聚糖)作为骨架进行免疫接种的新型可持续平台来说，确保所使用的多糖/寡糖诱导非常低水平的葡聚糖抗体或根本不诱导葡聚糖抗体是至关重要的。
48、葡聚糖粒子(gp)是高度纯化的2-4μm中空多孔细胞壁微球，主要包含β-(1,3)-d-葡聚糖，含有少量β-(1,6)-d-葡聚糖和几丁质，通常从酿酒酵母用一系列热碱、酸和有机萃取来分离。它们与其受体dectin-1和cr3相互作用(也有证据暗示与toll样受体和cd5相互作用，作为gp功能的其他因素)，并上调mhc分子的细胞表面呈递，导致改变共刺激分子的表达以及诱导促炎细胞因子的生成。由于其免疫调节特性，gp已被开发用于疫苗输送。
49、在疫苗中使用gp有三种常见方法：(i)作为与抗原共同施用的佐剂，以增强t细胞和b细胞介导的免疫应答，(ii)与抗原化学交联，最常见(iii)作为困在空心gp腔内的抗原的物理递送载体，以向apc提供靶向的抗原递送。
50、好处(i)：抗原特异性适应性免疫应答可以因gp与抗原共同施用而增强。在这种传统佐剂策略中，先天性和适应性免疫应答均被激活，以发挥针对病原体的保护性反应。例如，williams等(int j immunopharmacol.1989；11(4):403-10)通过共同施用gp，为灭活的克氏锥虫疫苗提供佐剂。使用这种配制剂引发的免疫应答导致小鼠受到克氏锥虫攻击后有85％存活。相比之下，仅接受葡萄糖、葡聚糖或疫苗的对照组死亡率为100％。
51、好处(ii)：gp的碳水化合物表面也可被共价修饰，是利用naio4氧化、碳二酰亚胺交联或1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓四氟硼酸介导的抗原与gp壳的偶联。使用这种方法，偶联效率非常低(约20％，参见例如pan et al.sci rep 5,10687(2015))，其显著限制了适用性和候选疫苗的数量，是与抗原包封在gp中或本技术建议的平台技术相比。这种共价连接的抗原-gp偶联物已用于癌症免疫疗法和传染病的研究。例如，pan等(2015)使用与高碘酸氧化的gp交联的ova对小鼠进行皮下免疫。当小鼠用表达ova的e.g7淋巴瘤细胞攻击时，观察到肿瘤大小显著缩小。皮下注射的12和36小时后，在淋巴结的dc(cd11c+mhc-ii+)中可检测到gp-ova。肿瘤保护作用与抗ova免疫球蛋白(ig)g总滴度的增加、mhc-ii和共刺激分子(cd80、cd86)表达的增强以及细胞毒性淋巴细胞应答的增强有关。
52、好处(iii)：在疫苗中使用gp的最有效方法是利用它们将疫苗/抗原封装到空心芯中。gp能以高荷载效率封装一种或多种抗原/dna/rna/佐剂/药物/其组合，这取决于有效载荷(payload)的类型和预期的递送方式。
53、抗原可以采用聚合物纳米复合方法封装在gp的空腔中，例如使用牛或鼠血清白蛋白和酵母rna/trna装载和复合有效载荷，或添加海藻酸-钙或海藻酸-钙-壳聚糖混合物。例如，huang等(clin.vaccine immunol.2013；20:1585–91)报告称，使用这些策略，接种gp-ova的小鼠表现出针对卵清蛋白的cd4+t细胞淋巴强烈增殖(一种th1和th17偏向的t细胞介导型免疫应答)以及高水平的igg1-和igg2c-特异性抗体应答。非共价封装策略比与抗原共同施用的gp引发了更强烈的免疫应答。
54、gp-封装的亚单位疫苗的例子是封装新型隐球菌(cryptococcus neoformans)无荚膜株(cap59)的可溶性碱提取物的gp，它通过诱导抗原特异性cd4+t细胞应答(ifn-γ、il-17a阳性)，使真菌菌落形成单位(cfu)比初始攻击剂量减少100倍以上，而为受到致死剂量的高毒力新型隐球菌攻击的小鼠提供保护(60％存活)(specht ca et al.mbio 2015；6:e01905–e1915.和specht ca et al.,mbio 2017；8:e01872–e1917.)。此外，给小鼠接种gp封装抗原已被证明能有效抵抗荚膜组织胞浆菌(histoplasma capsulatum)(deepe gs等，vaccine 2018；36:3359-67)、土拉弗朗西斯菌(f.tularensis)(whelan ao等，plos one2018；13：e0200213)、皮炎芽生菌(blastomyces dermatitidis)(wuthrich m等，cell hostmicrobe 2015；17:452-65)和波萨达球孢子菌(c.posadasii)(hurtgen bj等，infect.immun.2012；80:3960-74)。
55、除了癌症和传染病应用外，尚有少数使用自身抗原进行的研究使用gp作为疫苗递送的封装剂。沿着这些思路，rockenstein等(j.neurosci.，2018-01-24，38(4):1000-1014)描述了装载重组人α-突触核蛋白(asynuclein)(包含适合诱导抗asyn免疫应答的b细胞表位和t细胞表位)和雷帕霉素(已知可在小鼠突触核蛋白病模型中诱导抗原特异性调节性t细胞(treg))的gp的应用。正如之前使用全长α-突触核蛋白作为免疫原的研究所预期的那样，使用含有asyn的gp导致诱导强烈的抗α-突触核蛋白抗体滴度，并减轻动物中α-突触核蛋白引发的病理改变，其程度与之前发表的类似。添加雷帕霉素有效诱导了itregs(cd25和foxp3+)细胞的形成，因为雷帕霉素暴露后此类treg细胞的数量显著增加。因此，装载抗原α-突触核蛋白和雷帕霉素的gp在突触核蛋白病小鼠模型中触发神经保护性体液和itreg应答，联合疫苗(asyn+雷帕霉素)比单独的体液免疫接种(gp asyn)或细胞免疫接种(gp雷帕霉素)更有效。尚未报告与传统的非含α-突触核蛋白的gp免疫接种的效果相比较的信息。
56、β-葡聚糖新糖偶联物经由c型凝集素受体dectin-1有效靶向树突细胞，增强它们的免疫原性。具体地，某些β-葡聚糖还被用作使用模型抗原如ova疫苗接种的潜在载体(xieet al.,biochemical和biophysical research communications 391(2010)958–962；korotchenko et al.,allergy.2021；76:210–222.)or fusion proteins based on muc1(wang et al.,chem.commun.,2019,55,253)。
57、xie等和korotchenko等使用支链β-葡聚糖laminarin作为ova 偶联的骨架。然后通过表皮或皮下途径将这些葡糖新偶联物应用于小鼠。xie等表明，laminarin/ova偶联物而非这些化合物的未偶联混合物诱导了比单独的卵清蛋白增加的抗ova cd4+t细胞应答。重要的是，未偶联的laminarin的共注射阻断了这种增强，支持了laminarin介导的apc靶向功能。如预期的，天然ova以及ova和laminarin的混合物刺激了低水平的抗ova抗体生成。相反，ova/laminarin偶联物显著增强了抗体应答。同样，korotchenko等证明laminarin与ova偶联显著增加了bmdc的吸收和被诱导的活化、以及促炎细胞因子的分泌。lamova偶联物的这些特性还导致与bmdc共培养的ova特异性幼稚(naive)t细胞的刺激增强。在预防性免疫接种实验中，作者们可证实，lamova免疫接种与ova相比，在两次免疫接种后，致过敏特性减弱但诱导出高约三倍的igg1抗体滴度。但该效果在第三次免疫后的所有治疗组中消失，这时所有组都显示出相似的抗体滴度。lam/ova偶联物和ova/alum偶联物在小鼠过敏性哮喘模型中表现出可比的治疗效果。因此，这些实验未能提供葡聚糖基偶联物比传统疫苗明显更好的效果。
58、wang等(2019)分析了基于β-葡聚糖的muc1癌症疫苗候选物的效果。再次，muc1串联重复序列gvtsapdtrpapgstppah(一种研究充分的癌症生物标志物)被选为肽抗原，在重复序列内提供t细胞和b细胞表位。乙二醇(即peg)间隔物被用于将β-葡聚糖和muc1肽与酵母β-(1,3)-β-葡聚糖多糖连接起来，应用1,1'-羰基-二咪唑(cdi)介导的条件。β-葡聚糖-muc1纳米颗粒的大小在150nm范围内(实际平均162nm)，而未改性的β-葡聚糖形成约为540nm的颗粒。β-葡聚糖-muc1偶联物引发高滴度的抗muc1 igg抗体，比对照组明显更高。进一步分析生成的抗体的同种型和亚型显示，igg2b是主要亚型，表明th1型应答被激活，因为igg2b/igg1比>1。观察到的大量igm抗体表明有补体系统c3成分的参与，这通常会诱发细胞毒活性，且对于此类骨架的疫苗应用可能是问题，因为疫苗应避免产生细胞毒活性，例如对于慢性或退行性疾病而言。
59、us2013/171187 a1公开了一种免疫原性组合物，包含葡聚糖和药学上可接受的载体，以引发保护性抗葡聚糖抗体。metwali等(am.j.respir.crit.care med.185(2012),a4152；海报环节c31肺部炎症的调节)研究了葡聚糖衍生物在肺部炎症中的免疫调节作用。wo 2021/236809 a2公开了一种多表位疫苗，包含淀粉样蛋白-β和tau肽，用于治疗阿尔茨海默病(ad)。us2017/369570 a1公开了与针对肿瘤微环境中存在的细胞的抗体连接的β-(1,6)-葡聚糖。us2002/077288 a1公开了合成的、免疫原性的、但非淀粉样变性的、与淀粉样β同源的肽，单独或偶联用于治疗ad。us2013/171187 a1公开了抗葡聚糖抗体用作对抗白色念珠菌真菌感染的保护剂。wo 2004/012657 a2公开了微粒β-葡聚糖作为疫苗佐剂。cn113616799a公开了由氧化甘露聚糖和阳离子聚合物组成的疫苗载体。cn 111514286a公开了带有葡聚糖的zika病毒e蛋白偶联疫苗。us 4,590,181 a公开了病毒抗原与石耳聚糖或霉菌葡聚糖(mycodextran)混合的溶液。lang等(front.chem.8(2020):284)综述了疫苗开发中的碳水化合物偶联物。larsen等(vaccines 8(2020):226)报告称，石耳聚糖在体外激活鸡骨髓来源的树突细胞并促进对传染性支气管炎病毒的回体(ex vivo)cd4+t细胞记忆应答。us 2010/266626a1公开了葡聚糖，优选laminarin和卡德兰胶，作为与佐剂偶联的抗原用于抗真菌的免疫。mandler等(alzh.dement.15(2019),1133-1148)报告了靶向淀粉样β蛋白和α突触核蛋白的单一和联合免疫疗法在路易体痴呆样模型中的效果。mandler等(acta neuropathol.127(2014),861-879)报道了一种针对突触核蛋白病的下一代主动免疫方法，其使用免疫原性(b细胞应答)短肽，短到无法诱导t细胞应答(自身免疫)且不携带天然表位，而是携带一段模拟原始表位(例如寡聚α突触核蛋白)的序列，以及该方法在帕金森病(pd)临床试验中的应用。mandler等(mol.neurodegen.10(2015),10)报道，针对α突触核蛋白的主动免疫在多系统萎缩(msa)模型中改善退行性病理并防止脱髓鞘。jin等(vaccine 36(2018),5235-5244)综述了β-葡聚糖作为潜在免疫佐剂，主要关于佐剂性、构效关系和受体识别特性。wo 2022/060487 a1公开了含特定α-突触核蛋白肽的疫苗用于治疗神经退行性疾病。wo 2022/060488 a1公开了含淀粉样β蛋白和α-突触核蛋白肽的多表位疫苗用于治疗ad。us2009/169549 a1公开了修饰版α-突触核蛋白的构象异构体，其通过将半胱氨酸引入α-突触核蛋白多肽并打乱二硫键以形成稳定且具有免疫原性的异构体而产生。wo 2009/103105 a2公开的疫苗具有α-突触核蛋白表位(从天然α-突触核蛋白序列的氨基酸d115延伸至氨基酸n122)的模拟表位。
60、迄今，尚无人报道单个b细胞或t细胞表位肽与β-葡聚糖、特别是线性β-葡聚糖和/或对dectin-1有高结合特异性/能力的石耳聚糖偶联以形成本技术的新型葡萄糖偶联物的构建或使用。
技术实现思路
1、因此，本发明的目标是提供改进的疫苗，是接种抗原(vaccination antigen)与碳水化合物基clec佐剂的偶联疫苗，特别是所述疫苗在接种个体中比现有偶联疫苗的免疫应答有改进，特别是碳水化合物基clec-肽/蛋白质偶联疫苗。
2、本发明另一目标是提供疫苗组合物，其利用clec骨架赋予对短的、易于互换的、高度特异性的b/t细胞表位的免疫力，并且具有传统疫苗先前未达到的效力、特异性和亲和力。
3、本发明一个特定目标是提供用于真皮层(dermal compartment)的具有改进的选择性和/或特异性的clec基疫苗。
4、本发明另一目标是提供尽可能排他地诱导靶特异性免疫应答、同时不诱导或仅诱导非常有限的clec-或载体蛋白-特异性抗体应答的疫苗。
5、本发明另一目标是提供疫苗组合物，其利用clec骨架赋予对α突触核蛋白的短的、易于互换的、高度特异性的b/t细胞表位的免疫力，具有传统疫苗先前未满足的效力、特异性和亲和力，用于适当预防和治疗突触核蛋白病。
6、本发明的一个具体目标是提供用于真皮层的α突触核蛋白疫苗，其改进了clec基疫苗的选择性和/或特异性。
7、本发明的另一目标是提供尽可能排他地诱导α突触核蛋白特异性免疫应答同时不诱导或仅诱导非常有限的clec-或载体蛋白-特异性抗体应答的疫苗。
8、本发明的另一目标是提供α突触核蛋白(asyn)的肽免疫原构建体及其用于治疗突触核蛋白病的制剂。
9、因此，本发明提供了一种β-葡聚糖，用作b细胞和/或t细胞表位多肽的c型凝集素(clec)多糖佐剂，优选地，其中所述β-葡聚糖与b细胞和/或t细胞表位多肽共价偶联，形成β-葡聚糖与b细胞和/或t细胞表位多肽的偶联物，其中所述β-葡聚糖主要是线性的β-(1,6)-葡聚糖，且β-(1,6)-偶联单糖部分与非β-(1,6)-偶联单糖部分的比例至少为1∶1，优选至少为2∶1，更优选至少为5∶1，尤其是至少为10∶1。
10、本发明成功地解决了上述一个或多个目标。这对于本领域技术人员是意外的，因为迄今本领域尚无人报告，与本发明的新型、小的、模块化的葡萄糖偶联物类似的化合物的构建及应用或效力。
11、意外地，本发明显示，通过将肽/蛋白质与本发明所选clec-载体偶联(即共价结合；本文中同义)，其中偶联可以基于当前化学，获得了实现免疫应答的优质药物制剂。在现有技术中，有大量不同的偶联方法可用。在建立本发明的过程中，腙(hydrazone)形成或通过异双功能接头进行偶联是特别优选的方法。通常，偶联前的clec活化(例如：在糖部分的邻位oh基团上形成反应性醛)和在所选肽/蛋白质上存在反应性基团(例如n-或c-端酰肼(hydrazide)残基、sh基团(例如：经由n-或c-端半胱氨酸))是必需的。所述反应可以是单步骤反应(例如，将活化的clec与酰肼肽混合导致腙形成)，或多步骤过程(例如，活化的clec与来自异双功能接头的酰肼发生反应，随后肽/蛋白质借各自的反应基团偶联)。
12、因此，本发明偶联物的各个组分可以直接彼此偶联，例如通过将b细胞表位和/或t细胞表位偶联到β-葡聚糖和/或载体蛋白、或通过将β-葡聚糖偶联到载体蛋白(以所有可能的取向)。本文所述“b细胞表位多肽”或“t细胞表位多肽”默认是指“b细胞表位多肽”或“t细胞表位多肽”的b细胞或t细胞表位，而不是载体蛋白的b细胞或t细胞表位(如果存在)，除非明确提到载体蛋白的b细胞或t细胞表位。根据优选的实施方案，b细胞表位和/或t细胞表位与β-葡聚糖或甘露聚糖和/或载体蛋白的连接优选通过接头实现，更优选半胱氨酸残基或包含半胱氨酸或甘氨酸残基的接头，因酰肼介导的偶联导致的接头，经由异双功能接头偶联导致的街头，例如n-β-马来酰亚氨基丙酸酰肼(bmph)、4-[4-n-马来酰亚氨基苯基]丁酸酰肼(mpbh)、n-[ε-马来酰亚氨基己酸]酰肼(emch)或n-[κ-马来酰亚氨基十一烷酸]酰肼(kmuh)，通过咪唑介导的偶联，通过还原胺化，通过碳二酰亚胺偶联-nh-nh2接头；nrra、nrra-c或nrra-nh-nh 2接头，肽接头，例如双、三、四(或更多)体肽基团，例如cg或cg，或裂解位点，例如组织蛋白酶裂解位点；或它们的组合，尤其是半胱氨酸或nrra-nh-nh2接头。显然，“因(例如)酰肼介导的偶联导致的接头”是指偶联后导致的偶联物中的化学结构，即偶联后在所得偶联物中出现的化学结构。氨基酸接头在偶联形式中可以具有肽键(例如含甘氨酸的接头)或经由氨基酸的功能团(例如半胱氨酸接头的二硫键)。
13、通过使用本发明的clec骨架，本发明的新型偶联物被证明能赋予对短的、易于互换的、高度特异性的b/t细胞表位的免疫力，表现出此前未被传统疫苗满足的效力、特异性和亲和力：事实上，本发明的偶联物是首例将短的b细胞/t细胞表位用在clec基疫苗，避免了以融合蛋白的形式呈现这些表位的需求，包括形成这些表位的串联重复或不同串联重复的融合以形成稳定有效的免疫原(例如，上述带甘露聚糖的muc1方法所必需)。
14、利用本发明，还可以避免在clec疫苗中使用全长蛋白质(即葡聚糖粒子(gp)中的有效载荷)的必要性。此外，还可避免使用clec时由免疫原中出现的(不想要的)t细胞表位，像自身蛋白(例如：asyn、淀粉样β蛋白等中的t细胞表位)或混合自身表位(例如：用作免疫原的muc1串联重复))引起的自身免疫反应。
15、根据本发明，首次能将短表位(b-和/或t-细胞表位，主要是肽、修饰的肽)与功能性clec基骨架用基于成熟化学的共价偶联技术来联接，其中可以基于本领域众所周知的方法使可能的偶联方法适应于特定表位的要求。
16、本发明短肽的呈递可以制成单独偶联的部分(moities)，与单个外来t细胞表位(作为短肽或长蛋白)组合，或制成与较大载体分子的复合物/偶联物，提供t细胞表位以诱导可持续的免疫应答。本发明的疫苗设计允许制备多价偶联物，这是由高效b细胞受体(bcr)交联来诱导有效免疫应答的先决条件。
17、此外，利用本发明，可以提供一种具有极佳的真皮层选择性/特异性的clec基疫苗。事实上，本发明的偶联物设计是在clec上搭建，以clec为靶特异性表位的载体，其对真皮apc/dc上的prr，尤其是对dectin-1(或在甘露聚糖的情况下为mr和dc-sign)表现出高结合特异性，以允许皮肤选择性/特异性的和受体介导的摄入(＝靶向疫苗递送)。
18、根据本发明被用作载体的clec多糖被用于将载体-肽偶联物集中至优选的真皮/皮肤dc中、并引发免疫应答。这主要是由于表皮或真皮(而非皮下)特异性。本发明的clec骨架和有效的真皮免疫应答引发还有助于避免强制使用佐剂，佐剂通常用于常规疫苗并且也用于示例性clec基疫苗中(例如：使用alum、mf59、cfa、polyi:c或其他佐剂)。根据本发明的优选实施方案，佐剂的使用可以显著减少或省略，例如在未指明添加佐剂的情况下。
19、之前的应用中已用到数种clec，但所提议的偶联结构没有一个能赋予皮肤选择性(即真皮应用与所有其他途径(即皮下、肌肉内和i.p.(腹腔注射))相比的高dectin-1结合能力、高效的真皮dc靶向性和优秀的免疫原性)。
20、本发明选择clec是为了提供一种新颖的解决方案，以高效的方式靶向皮肤特异性dc和皮肤特异性免疫。本发明的偶联物还在其他经典组织(如肌肉或皮下组织)免疫中发挥有限的活性，这与之前描述的i.m.(肌肉)或s.c.(皮下)应用的clec基疫苗/候选疫苗相反。本发明过程中进行的实验的结果是，本发明的疫苗，尤其以石耳聚糖为clec的疫苗，被证实对皮肤免疫具有惊人的选择性。
21、本发明涉及任何b细胞和/或t细胞表位多肽和任何主要为线性的β-(1,6)-葡聚糖，其(1,6)偶联单糖部分与非(1,6)偶联单糖部分的比例至少为1:1。如实施例章节所示，本文的教导支持任何b细胞和/或t细胞表位多肽，且此类表位未发现任何限制，特别是当这些表位已经是在先和/或现有表位的一部分时。本文所示和提及的特异性b细胞和/或t细胞表位多肽是优选表位，但本发明不限于此。在本发明的过程中，以及在迄今测试了众多表位(见实施例章节中调查并实验证实的功能和结构非常多样化的表位(包括大量模型表位))之后，没有发现对b细胞和/或t细胞表位的性质和结构有任何限制(线性多肽，自身肽，具有翻译后修饰的多肽，例如糖结构或焦谷氨酸，模拟表位，过敏原，结构表位，构象表位等)，尤其是对于作为β-(1,6)-葡聚糖的石耳聚糖。在一例中，实验表明，正是本发明的β-葡聚糖和与表位多肽的共价结合决定了免疫表现，而不是单个表位的具体结构特征。
22、本文中术语“b细胞和/或t细胞表位多肽”是本领域认可的功能术语：t细胞表位呈现在抗原呈递细胞的表面上，在那里它们与主要组织相容性复合体(mhc)分子结合。在人类中，专业的抗原呈递细胞专门呈递mhc ii类肽，而大多数有核的体细胞呈递mhc i类肽。由mhc i类分子呈递的t细胞表位通常是长度为8～11个氨基酸的肽，而mhc ii类分子呈递较长的肽(13～17个氨基酸)，非典型mhc分子也呈递非-肽的表位例如糖脂。b细胞表位是抗原上被免疫球蛋白或抗体结合的部分。b细胞表位可以是例如构象的或线性的。
23、根据本发明一个优选实施方案，本发明的偶联物包括具有至少一个b细胞表位和至少一个t细胞表位的多肽，优选与β-葡聚糖共价连接的b细胞表位+crm197偶联物，尤其是肽+crm197+线性β-(1,6)-葡聚糖或肽+crm197+线性石耳聚糖偶联物。优选的葡聚糖与肽的比例，特别是石耳聚糖与肽的比例，为10比1(w/w)～0.1比1(w/w)，优选8比1(w/w)～2比1(w/w)，特别是4比1(w/w)，当偶联物包含载体蛋白，则β-葡聚糖或甘露聚糖与b细胞表位-载体多肽的优选比例为50比1(w/w)～0.1比1(w/w)，特别是10比1～0.1比1。
24、利用本发明，可以专注于诱导靶特异性免疫应答，而不诱导或仅诱导非常有限的clec-或载体-蛋白特异性抗体应答。本发明的偶联物由此解决了传统偶联疫苗所带来的问题，即必须依靠使用外来载体蛋白诱导可持续的免疫应答。现有偶联疫苗开发主要建立在载体分子上，例如klh、crm197、破伤风类毒素或其他合适的蛋白质，它们与靶特异性短抗原形成复合物，将其提供给免疫反应以抵抗不同的目标疾病像传染病、退行性或肿瘤性疾病，包括例如her2-neu阳性癌症，α突触核蛋白用于帕金森病等突触核蛋白病，淀粉样β肽用于阿尔茨海默病等淀粉样变性，tau用于治疗包括阿尔茨海默病在内的tau蛋白病(tauopathies)，pcsk9用于高胆固醇血症，il23用于牛皮癣，tdp43和fus用于额颞叶变性(ftld)和肌萎缩侧索硬化症(als)，(突变型)亨廷顿蛋白用于亨廷顿病，免疫球蛋白轻链和重链淀粉样变性(al，ah，aa)，胰岛淀粉样多肽(iapp)和胰淀素(amylin)用于2型糖尿病，(突变型)转甲状腺素蛋白用于attr/转甲状腺素淀粉样变性，等等。
25、考虑到现有技术的指引，本发明的偶联物以及包含这些偶联物的疫苗的免疫表现和效力也是出乎意料且令人惊讶的，在现有技术中，β-葡聚糖，尤其是以线性为主的β-(1,6)-葡聚糖，主要被用作抗原本身，以引发针对存在此类β-葡聚糖的真菌的特异性免疫应答(见例如us2013/171187 a1；metwali et al.,am.j.respir.crit.care med.185(2012),a4152；poster session c31；us2013/171187 a1,us2010/266626a1,jin et al.(vaccine36(2018),5235-5244))。然而，本发明证实，本发明的偶联物不能引发对β-葡聚糖的显著免疫应答，但–由于本偶联物的构造–免疫应答转移到与β-葡聚糖共价偶联的b细胞和/或t细胞表位多肽。将这些b细胞和/或t细胞表位多肽与线性β-葡聚糖偶联似乎隐藏了β-葡聚糖的免疫应答引发能力，但暴露并显著改进了共价结合的b细胞和/或t细胞表位多肽向免疫系统的呈递。此教导既未在现有技术中公开，也非现有技术显而易见：
26、us2017/369570 a1公开了β-(1,6)-葡聚糖与抗肿瘤微环境中细胞的抗体相连，是基于完全不同的概念和机制(肿瘤治疗)。
27、另一方面，葡聚糖被用作疫苗的成分(最常见是“(脂质体)葡聚糖(纳米)颗粒”)，但未将b细胞和/或t细胞表位多肽共价偶联到葡聚糖(例如wo 2004/012657a2,cn113616799 a,us 4,590,181 a,lang et al.,front.chem.8(2020):284；larsen et al.,vaccines 8(2020):226)。
28、最后，本发明的主要为线性的β-(1,6)-葡聚糖相对于wo 2022/060487 a1、wo2022/060488a1、us2009/169549a1、wo 2009/103105和cn 111514286 a所述的构建体和组合物(例如β-(1,2)-葡聚糖或β-(1,3)-葡聚糖)的改进效果已在下文实施例章节中证实。
29、考虑到本发明偶联物的这些有利特性，本发明的偶联物和疫苗特别适用于主动抗tau蛋白疫苗接种，也包括经过截短、(高)磷酸化、硝化、糖基化和/或泛素化的变体，用于治疗和预防tau蛋白病，特别是阿尔茨海默病和唐氏综合症或其他tau蛋白病，包括皮克(pick)病、进行性核上性麻痹(psp)、皮层基底节变性、与第17号染色体相关的额颞叶痴呆和帕金森病(ftdp-17)和嗜银性谷物病。新出现的其他疾病和病症包括球状胶质细胞tau蛋白病、原发性老年性tau蛋白病(part)，其包括神经纤维缠结性痴呆、慢性创伤性脑病(cte)、和老年性tau星形胶质细胞病。此外，还包括其他疾病，如空泡性tau蛋白病、神经节胶质瘤和神经节细胞瘤、lytico-bodig病(关岛帕金森痴呆综合征)、脑膜血管瘤病、脑炎后帕金森病和亚急性硬化性全脑炎(sspe)。
30、tau蛋白病经常与突触核蛋白病(synucleinopathy)重叠，可能是由于突触核蛋白和tau蛋白之间的相互作用。因此，本发明的抗tau偶联物特别适用于针对突触核蛋白病的主动抗tau蛋白疫苗接种，尤其是帕金森病(pd)、路易体痴呆(dlb)和帕金森病痴呆(pdd)。
31、抗tau疫苗单独使用或与针对涉及β-淀粉样变性、tau蛋白病或突触核蛋白病、尤其是混合病理(即存在aβ病理和tau病理和/或asyn病理)的其他病理分子的现有肽疫苗联合使用时可能非常有效。因此，优选的实施方案是提供抗tau疫苗与抗aβ和/或抗asyn肽疫苗的组合，以治疗退化性疾病，如阿尔茨海默病、唐氏综合征痴呆、路易体痴呆、帕金森病痴呆、帕金森病。
32、根据优选实施方案，tau蛋白衍生的多肽选自天然人tau(441aa同工型；genbank登录号>aac04279.1；seq id no
33、
34、或包含或由源自人tau的氨基酸残基组成的多肽，包括翻译后修饰、磷酸化、双磷酸化、超磷酸化、硝化、糖基化和/或泛素化的氨基酸，包括tau2-18,tau 176-186,tau 181-210,tau 200-207,tau 201-230,tau 210-218,tau 213-221,tau 225-234,tau 235–246,tau 251-280,tau 256-285,tau 259-288,tau 275-304,tau260-264,tau 267-273,tau294-305,tau 298-304,tau 300-317,tau 329-335,tau 361-367,tau 362-366,tau379–408,tau 389-408,tau 391-408,tau 393-402,tau 393-406,tau393-408,tau418-426,tau 420-426。
35、根据一个优选实施方案，所述tau蛋白衍生多肽选自上述tau衍生多肽的模拟物，包括模拟表位和含有氨基酸取代(以模拟磷酸化的氨基酸，包括磷酸化的s被d取代、磷酸化的t被e取代)的肽，分别包括tau176-186,tau200-207,tau210-218,tau213-221,tau225-234,tau379–408,tau389-408,tau391-408,tau393-402,tau393-406,tau418-426,tau420-426。
36、us2008/050383 a1以及asuni等(journal of neuroscience 34:9115–9129)公开了针对tau379–408的抗体具有两个磷酸化的aas：ps396和ps404，适用于针对tau病理的免疫疗法，而boutajangout等(j.neurosci.，2010年12月8日30(49):16559–16566)公开了使用相同表位：双磷酸化多肽tau379–408带psp396和ps404联合佐剂adjuphos，与主动免疫治疗剂一样有效，在htau/ps1模型的几项测试中防止认知能力下降，这与脑内病理性tau的减少有关。bi等(2011,plos one 12:e26860.)还表明，使用来自双磷酸化序列tau395-406(携带ps396和ps404)的10体多肽与klh偶联并佐以完全或不完全弗氏佐剂进行tau靶向免疫，阻碍了老年p301l tau转基因小鼠的神经原纤维组织病理学进展。
37、boimel m等(2010；exp neurol 2：472–485)证明，使用完全弗氏佐剂(cfa)中乳化的双磷酸化肽tau195-213[ps202/pt205]、tau207-220[pt212/ps214]和tau224-238[pt231]和百日咳毒素，导致减轻动物体内的tau相关病理。
38、troquier等(2012curr alzheimer res 4:397–405)证明，在thytau22小鼠模型中用人工肽构建体(由n端ygg接头与源自携ps422之人tau的7-肽(tau418-426)或11-肽(tau417-427)融合，偶联klh并佐以cfa)通过主动tau免疫疗法来靶向tau，可以是一种合适的疗法，因为可以检测到不溶性tau种类(at100-和ps422-免疫反应性种类)的减少与使用y型迷宫的显著认知改善相关。
39、us2015/0232524 a1以及davtyan h等(sci rep.2016；6:28912,vaccine.2017；35:2015–24和alzheimer's research&therapy(2019)11:107)和joly-amado等(neurobioldis.2020年2月；134:104636)公开了肽免疫原，并表明疫苗av-1980r和av-1980d均基于multitep平台，由与数个混杂型t细胞表位融合的3个重复的tau2-18作为重组多肽或作为dna疫苗而组成，在不同的tau病变模型中诱导强烈的免疫应答并减少tau病理。
40、ep 3 097 925 b1公开了由源自人tau441的磷酸-肽组成的肽免疫原，theunis等(2013，plos one 8(8):e72301)展示了基于ep 3 097 925 b1的一种携带tau肽tau 393-408(携ps396和ps402)的脂质体疫苗，其在tau.p301l小鼠脑中能引发抗磷酸化tau的抗体，伴有临床状况的改善和tau蛋白病的指数降低。
41、sun等(signal transduction and targeted therapy(2021)6:61)公开了基于诺如病毒p粒子的各种免疫原。疫苗ptau31(由含有tau195-213(携ps202和pt205)与tau395-406(携ps396和ps404)的融合肽的粒子组成)产生了强大的ptau抗体，可以显著减少tau病理并改善tau tg动物模型中的行为缺陷。
42、ep 2 758 433 b1公开了用于干扰tau病理的肽基免疫原。本发明公开了用作肽偶联物疫苗(例如：肽klh疫苗)。kontsekova等(alzheimer's research&therapy 2014,6:44)公开了此类肽疫苗(即与klh偶联并佐以alum的axon肽108(tau294-305；kdnikhvpgggs)；也称为aadvac1)诱导了强大的保护性体液免疫应答，其中的抗体可区分病理性tau和生理性tau。主动免疫疗法降低了转基因大鼠脑中tau寡聚体的水平和神经原纤维病理的程度。
43、虽然从原则上讲，本发明能改进所有建议的tau疫苗接种多肽，但选定的表位会根据其与本平台的适用性进行专门评估。例如，tau294-305，seqid35+36被证明优于klh基疫苗，如ep2 758 433b1和kontsekova等所建议的。
44、进一步优选的靶序列包括：
45、
46、
47、鉴于本发明偶联物的这些有利特性，本发明的偶联物和疫苗特别适用于il12/il23相关疾病和自身免疫性炎症疾病的主动免疫治疗。il-23相关疾病选自银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、糖尿病(优选1型糖尿病)、动脉粥样硬化、炎症性肠病(ibd)/m.crohn病、多发性硬化症、behcet病、强直性脊柱炎、vogt-koyanagi-harada病、慢性肉芽肿病、化脓性汗腺炎(hidratenitis suppurtiva)、抗中性粒细胞胞质抗体(anca-)相关血管炎、神经退行性疾病(优选阿尔茨海默氏症或多发性硬化症)、特应性皮炎、移植物抗宿主病、癌症(优选食道癌、结直肠癌、肺腺癌、小细胞癌、和口腔鳞状细胞癌，尤其是牛皮癣、神经退行性疾病或ibd。此外，il-12/23定向疫苗可与抗其他靶标的疫苗一起/组合使用，因为最近的数据表明il-23驱动的炎症可加剧其他疾病，例如阿尔茨海默氏病或可能的糖尿病。
48、根据优选实施方案，il12/il23蛋白衍生多肽衍生自天然人il12/il23或有一个或多个aa(氨基酸)交换从而形成相应天然序列的模拟表位的模拟物。
49、根据优选的实施方案，il12/il23蛋白衍生的多肽选自异二聚体蛋白il23的亚基、天然人il-23p19或包含或由源自该亚基或模拟表位的氨基酸残基组成的多肽。在wo 2005/108425 a1中，提出了源自il-23p19的肽fyekllgsdiftge,fyekllgsdiftgepsllpdsp,vaqlhasllglsqllqp,gepsllpdspvaqlhasllglsqllqp,peghhwetqqipslspsqp,psllpdsp,lpdspva,fyekllgsdiftgepsllpdspvaqlhasllglsqllqp,llpdsp,llgsdiftgepsllpdspvaqlhasllg,fyekllgsdiftgepsllpdspvaqlhasllg,qpeghhw,lpdspvgqlhasllglsqllq和qcqqlsqklctlawsahplv作为il-23的疫苗接种肽。在wo 03/084979a2中，来自il-23p19的ghmdlreegdeett,llpdspvgqlhasllglsq和llrfkilrslqafvavaarv被提及为可能的抗细胞因子疫苗。wo 2016/193405 a1公开了源自il12/23p19亚基(登录号：q9npf7)的具有以下氨基酸序列的肽免疫原
50、
51、作为可能的抗细胞因子疫苗，特别是其aa136-145,aa136-143,aa 136-151,aa137-146,aa144-154,aa144-155及其它，特别是序列：qpeghhwetqqipsls,ghhwetqqipslspsqpwqrl,qpeghhwetq,tqqipslspsq,qpeghhwetqqipslspsq,qpeghhwetqqipslsps。
52、根据优选的实施方案，il12/il23蛋白衍生的多肽选自异二聚体蛋白il23的亚基、天然人il12/23p40或包含或由天然人il12/23p40(登录号：p29460.1)的氨基酸残基aa15-66,aa38-46,aa53-71,aa119-130,aa160-177,aa236-253,aa274-285,aa315-330组成的多肽，其具有以下氨基酸序列：
53、
54、在wo 03/084979a2中，提到肽lllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrce和kssrgssdpqg来自il-12/23p40亚基，被作为可能的抗细胞因子疫苗。
55、luo等，j mol biol 2010-10-8；402(5)：797-812公开了抗il12/il23p40特异性抗体ustekinumab的构象表位-aa15-66，其有效减少il12(il23)相关疾病。guan等(vaccine27(2009)7096-7104)公开了鼠il12/23的免疫原aa38-46、aa53-71、aa119-130、aa160-177、aa236-253、aa274-285、aa315-330，登录号：p43432(p40)和q9eq14(p19))具有以下氨基酸序列：p43432(p40)：
56、
57、；重组加入hbcag。
58、虽然原则上，本发明能改进所有建议的il12/il23相关疾病疫苗多肽，但选定的表位被专门评估了其与本平台的适用性。例如，seqid37/38和seqid41/42wisit疫苗被证明优于klh基疫苗。鼠序列seqid39/40在小鼠中表现出与klh基偶联物相似的效力，在il12/23识别中也具有活性。
59、鉴于本发明的偶联物的这些有利特性，本发明的偶联物和疫苗特别适用于主动抗empd(膜外近端结构域，作为膜ige-bc的一部分)疫苗接种，用于治疗和预防ige相关疾病。排他性靶向和交联膜ige-bcr通过触及仅在膜ige上而非可溶性血清ige上发现的膜锚定区(即胞外的膜近端结构域ige(empd ige))实现。ige相关疾病包括过敏性疾病，例如季节性、食物、花粉、霉菌孢子、有毒植物、医疗/药物、昆虫-、蝎子-或蜘蛛-毒液、乳胶或灰尘过敏,宠物过敏,过敏性支气管哮喘,非过敏性哮喘,churg-strauss综合征,过敏性鼻炎和-结膜炎,特应性皮炎,鼻息肉,木村病,针对粘合剂、抗菌剂、香料、染发剂、金属、橡胶成分、外用药物、松香、蜡、抛光剂、水泥和皮革的接触性皮炎,慢性鼻窦炎,特应性湿疹,ige发挥作用的自身免疫病(“自身过敏症”),慢性(特发性)和自身免疫性荨麻疹,胆碱能性荨麻疹,肥大细胞增多症，尤其是皮肤肥大细胞增多症,过敏性支气管肺曲霉病,慢性或复发性特发性血管性水肿,间质性膀胱炎,过敏反应，尤其是特发性和运动诱发的过敏反应,免疫疗法,嗜酸性粒细胞相关疾病，例如嗜酸性哮喘,嗜酸性胃肠炎,嗜酸性中耳炎和嗜酸性食管炎(参见例如holgate 2014world allergy organ.j.7:17.,us 8,741,294 b2)。此外，本发明的疫苗或偶联物用于治疗淋巴瘤或预防抗酸治疗(尤其是用于胃或十二指肠溃疡或反流)的致敏副作用。对于本发明而言，术语“ige相关疾病”包括或与术语“ige依赖性疾病”或“ige介导的疾病”同义使用。
60、根据优选实施方案，empd蛋白衍生的多肽源自天然人ige-bcr或是有一个或多个aa交换的模拟物以形成相应天然序列的模拟表位。
61、特异性靶向人或小鼠empd ige的专用抗体的研发允许在体外和体内对该靶向策略进行临床和临床前验证(liour等，2016pediatr allergy immunol 8月；27(5):446-51)。ige-bcr交联概念首次在体内得到证实，是通过在野生型小鼠(feichtner等，2008j.immunol.180:5499–5505)和有部分人源化ige empd区域的专用小鼠模型(brightbill等，2010j.clin.invest.120:2218–2229)中被动施用抗empd ige抗体。chen等(2010journal of immunology 184,1748–1756)表明，特异于cemx的n端或中间节段的mab可与表达mige的b细胞结合并有效诱导其凋亡和adcc。cemx指人类膜结合e链。该同工型包含一个52aa残基的额外结构域，位于ch4结构域和c端膜锚肽之间，称为cemx或m1'肽。这特别体现在抗cemx n端节段p1(svnpglaggsaqsqrapdrvl，其中svnp代表m的ch4结构域的c端4个aa残基)和中间节段p2(hsgqqqglpraaggsvphpr)的抗体中，而c端p3(gagradwpgpp)则未成功。
62、此外，针对人empd ige区主动免疫产生的抗体能在体外介导细胞凋亡和adcc(lin等，mol.immunol.，52(2012)，190-199页)。lin等公开了使用携有cemx或其p1、p2和p1-p2部分的插入物的hbcag的免疫原作为抗empd疫苗。
63、首个临床抗人empd ige单克隆抗体quilizumab分别在i期和ii期研究中在健康志愿者中表现出选择性ige抑制作用，并在过敏性鼻炎和轻度哮喘患者中表现出临床益处(scheerens等，2012asthma therapy:novel approaches:p.a6791；gauvreau等，2014sci.transl.med.6,243ra85.)，但未能改善重度支气管哮喘患者的临床结果(harris等，2016respir.res.17:29.)。quilizumab的表位也可作为潜在的免疫原，位于cemx的一个11残基节段saqsqrapdrv内。
64、wo 2017/005851 a1和vigl等(journal of immunological methods 449(2017)28–36)公开了肽作为活性抗empd免疫原与位于empd膜近端结构域中的合适蛋白载体的组合。公开的序列包括
65、avsvnpglaggsaqsqrapdrvlchsgqqqglpraaggsvp,qqqglpraagg,qqlglpraagg,qqqglpraaeg,qqlglpraaeg,qqqglpraag,qqlglpraag,qqqglpraae,qqlglpraae,hsgqqqglpraagg,hsgqqlglpraagg,hsgqqqglpraaeg,hsgqqlglpraaeg,qsqrapdrvlchsg,gsaqsqrapdrvl,和wpgppeldv。
66、虽然原则上，本发明能改进所有建议的ige相关疾病疫苗多肽，但选定的表位会根据其对本平台的适用性进行专门评估。例如，seqid43/44(qqqglpraagg)被证明优于klh基疫苗。
67、鉴于本发明的偶联物的这些有利特性，本发明的偶联物和疫苗特别适用于主动抗人表皮生长因子受体2(抗her2)疫苗接种，用于治疗和预防her2阳性肿瘤疾病。her2的扩增或过度表达发生在约15-30％的乳腺癌和10-30％的胃/胃食管癌中，并可作为预后和预测性生物标志物。her2过度表达也见于其他癌症，如卵巢癌、子宫内膜癌和子宫浆液性子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌和头颈部癌。根据优选实施方案，her2蛋白衍生的多肽衍生自天然人her2，或是有一个或多个氨基酸交换的模拟物，形成相应天然序列的模拟表位。
68、dakappagari等(jbc(2005)280,1,54–63)披露了构象表位aa626–649与来自麻疹病毒融合蛋白mvf的混杂th表位(氨基酸288–302)共线合成，并通过二硫键环化。肽与胞壁酰二肽佐剂nor-mdp(n-乙酰葡糖胺-3基-乙酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺)一起配制，并在montanide isa 720中乳化。疫苗具有免疫原性，使用疫苗进行免疫减轻肿瘤模型中的肿瘤负担。
69、ep 1 912 680 b1和allen等(j immunol 2007；179:472-482)披露了使用三种构象肽构建体(aa266-296(lhcpalvtyntdtfesmpnpegrytfgascv),aa298-333(acpynylstdvgsctlvcplhnqevtaedgtqrcek)和aa315-333(cplhnqevtaedgtqrcek)的免疫原，以模拟受体二聚化环的区域。候选疫苗还含有mvf t细胞表位(aa 288–302)kllslikgvivhrlegve和gpsl-接头。所有肽均引发高抗her2免疫应答，使用肽aa266–296的构建体与herceptin等效。her2序列的aa266-296肽(登录号p04626)：
70、
71、作为疫苗在两种可移植的肿瘤模型中均显著降低了肿瘤的发生率，并在两种转基因小鼠肿瘤模型中显著减少了肿瘤的发展。
72、garret等(j immunol 2007；178:7120-7131)披露her2肽作为免疫原aa563-598,aa585-598、aa597-626和aa613-626与来自麻疹病毒融合蛋白(aa 288-302)的混杂th表位共线合成并与montanide isa 720联合使用。疫苗具有免疫原性，使用携aa597-626表位的疫苗进行免疫显著降低肿瘤模型中的肿瘤负担。
73、jasinska等(int.j.cancer:107,976-983(2003))公开了her2胞外结构域的7种肽作为癌症免疫疗法的潜在抗原：p1 aa115–132avldngdplnnttpvtga,p2aa149–162lkggvliqrnpqlc,p3 aa274–295yntdtfesmpnpegrytfgas,p4aa378–398pesfdgdpasntaplqpeqlq,p5 aa489–504phqallhtanrpede,p6aa544–560crvlqglpreyvnarhc,p7 aa610–623ympiwkfpdeegac，它们与破伤风类毒素偶联，使用gerbu佐剂，诱导的体液免疫应答在动物模型中具有抗肿瘤活性。同样，wagner等(2007breast cancer res treat.2007；106:29–38)公开了免疫研究用的肽免疫原，用了与破伤风类毒素偶联并有gerbu佐剂的单个肽p4(aa378–394:pesfdgdpasntaplqpc),p6(aa545–560:rvlqglpreyvnarhc)和p7(aa610–623:ympiwkfpdeegac)。在加或不加il12的情况下进行疫苗接种，导致临床前模型中的抗肿瘤效力。tobias等2017(bmc cancer(2017)17:118)公开了免疫研究用的肽免疫原，用到单个肽p4(aa378–394:pesfdgdpasntaplqp),p6(aa545–560:rvlqglpreyvnarhc)和p7(aa610–623:ympiwkfpdeegac)组合成杂肽p467(pesfdgdpasntaplqprvlqglpreyvnarhslpympiwkfpdeegac)和p647(rvlqglpreyvnarhspesfdgdpasntaplqpympiwkfpdeegac)。p6的半胱氨酸(c)分别被“slp”或“s”取代。这两种构建体要么与病毒体偶联，要么与白喉类毒素crm197(crm)偶联，并与作为佐剂的montanide或氢氧化钠(alum)组合，诱导的抗体表现出抗肿瘤特性。
74、riemer等(j immunol 2004；173:394-401)报道了用受限的10体噬菌体展示文库生成曲妥珠单抗在her-2/neu上识别的表位的肽模拟物。将肽模拟物偶联到免疫原性载体破伤风类毒素(tt)上，并佐以氢氧化铝。序列包含：c-qmwapqwgpd-c,c-klywadgelt-c,c-vdyhyegtit-c,c-qmwapqwgpd-c,c-klywadgelt-c,c-klywadgeft-c,c-vdyhyegtit-c,c-vdyhyegait-c。类似地，singer等(oncoimmunology 2016,5(7),e1171446)公开了从aav-模拟表位库平台推导的曲妥珠单抗表位的模拟表位。测试的模拟表位序列包括rlvpvglergtvdwv,trwqkglalgsgdma,qvshwvsglaegsfg,lshtsgrvegsvsll,ldstslaggpyeaie,hvvmnwmreefveef,swasgmavgsvsfee.qvshwvsglaegsfg和lshtsgrvegsvsll被证明有免疫原性且在肿瘤模型中有效。
75、miyako等(anticancer research 31:3361-3368(2011))公开了尤其是来自her-2/neu胞外结构域(aa167-175)的肽，为her-2/neu相关多抗原肽(map)的形式。her-2/neu肽含有cd4+和cd8+t细胞的表位，导致抑制表达her-2/neu的肿瘤细胞生长。公开的序列包括：
76、肽序列(b；叔丁氧羰基残基(boc))。
77、n:143-162(rslteilkggvliqrnpqlc-bbb)8-k4k2kb
78、n:153-172(vliqrnpqlcyqdtilwkdi-bbb)8-k4k2kb
79、n:163-182(yqdtilwkdifhknnqlalt-bbb)8-k4k2kb
80、n:173-192(fhknnqlaltlidtnrsrac-bbb)8-k4k2kb
81、n:183-202(lidtnrsrachpcsmpckgs-bbb)8-k4k2kb
82、n:193-212(hpcsmpckgsrcwgessedc-bbb)8-k4k2kb
83、n:203-222(rcwgessedcqsltrtvcag-bbb)8-k4k2kb
84、n:213-232(qsltrtvcaggcarckgplp-bbb)8-k4k2kb
85、n:223-242(gcarckgplptdccheqcaa-bbb)8-k4k2kb
86、n:233-252(tdccheqcaagctgpkhsdc-bbb)8-k4k2kb
87、n:243-263(gctgpkhsdclaclhfnhsg-bbb)8-k4k2kb
88、n:253-272(laclhfnhsgicelhcpalv-bbb)8-k4k2kb
89、n:263-282(icelhcpalvtyntdtfesm-bbb)8-k4k2kb
90、n:273-292(tyntdtfesmpnpegrytfg-bbb)8-k4k2kb
91、n:283-302(pnpegrytfgascvtacpyn-bbb)8-k4k2kb
92、n:292-310(gascvtacpynylstdvgs-bbb)8-k4k2kb
93、n:300-321(pynylstdvgsctlvcplhnqe-bbb)8-k4k2kb
94、n:312-330(tlvcplhnqevtaedgtqr-bbb)8-k4k2kb
95、n:322-341(vtaedgtqrcekcskpcarv-bbb)8-k4k2kb
96、n:332-351(ekcskpcarvcyglgmehlr-bbb)8-k4k2kb
97、n:343-361(yglgmehlrevravtsani-bbb)8-k4k2kb
98、n:352-370(evravtsaniqefagckki-bbb)8-k4k2kb
99、体液免疫应答被诱导，免疫过的小鼠的肿瘤生长受到抑制，肿瘤浸润淋巴细胞包含更多的cd8+t细胞，在肽再刺激后分泌出大量的白细胞介素2。
100、henle等(j immunol.2013年1月1日；190(1):479-488)公开了源自her2的肽表位，其产生交叉反应性t细胞。对于her-2/neu hla-a2结合肽aa369-377(kifgslafl)，已显示对该表位特异的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)可直接杀死her-2/neu过表达乳腺癌细胞。公开的其他表位包括her-2/neu肽p368–376,kkifgslaf；p372–380,gslaflpes；p364–373,fagckkifgs；p373–382,slaflpesfd；p364–382,fagckkifgslaflpesfd；以及p362–384,qefagckkifgslaflpesfdgd。这些序列中，序列p373–382(slaflpesfd)比p369–377与hla-a2的结合更强，被确定为疫苗接种的潜在表位。
101、kaumaya等(oncoimmunology 2020，9(1)e1818437)公开了her2靶向疫苗(aa266-296和aa597-626与麻疹病毒融合肽(mvf)氨基酸288-302经由四个氨基酸残基(gpsl)组合并乳化于montanide isa 720vg中)和新型pd1免疫检查点靶向疫苗(pd-1b细胞肽表位(aa92-110；gaislapkaqikeslrael)与病毒融合肽(mvf)氨基酸288-302经由四个氨基酸残基(gpsl)组合并于montanide isa 720vg中乳化)用于联合治疗her2阳性疾病。因此，提供抗肿瘤疾病疫苗的组合，尤其是癌症靶特异性疫苗和免疫检查点靶向疫苗的组合也是一个优选的实施方案。
102、虽然从原则上讲，本发明能改进所有建议的her2相关疾病疫苗多肽，但选定的表位会根据其与本平台的适用性进行专门评估。例如，seqid no47/48(aa610-623:ympiwkfpdeegac)被证明优于crm基疫苗。
103、鉴于本发明的偶联物的这些有利特性，本发明的偶联物和疫苗特别适用于个体化新抗原特异性疗法，优选有ny-eso-1,mage-a1,mage-a3,mage-c1,mage-c2,mage-c3,survivin,gp100,酪氨酸酶,ct7,wt1,psa,psca,psma,steap1,pap,muc1,5t4,kras或her2。
104、鉴于本发明偶联物的这些有利特性，本发明的偶联物和疫苗特别适用于主动抗免疫检查点疫苗接种，以控制癌症微环境，治疗和预防肿瘤疾病以及治疗和预防癌症/肿瘤疾病中的t细胞功能障碍(例如避免浸润癌组织的cd8 t细胞耗竭)和慢性退行性疾病，包括t细胞活性降低的疾病，如帕金森病。
105、业内普遍认为，与健康对照者相比，pd(帕金森病)患者的t细胞区室发生了不同的变化(例如：bas等，j neuroimmunol 2001；113:146-52或gruden等，j neuroimmunol 2011；233:221-7)。pd中t细胞的此类表型变化包括：绝对淋巴细胞计数减少、总t细胞绝对计数和相对计数减少、cd4+淋巴细胞绝对计数和相对计数减少，有时cd8+淋巴细胞也减少，th1/th2和th17/treg比率增加以及炎性细胞因子表达增加。然而，大多数这些变化也会在健康衰老过程中发现，因此很难辨别疾病(如pd)的影响，pd的发病年龄范围很广(约30-90岁)，进展速度也各不相同。关于绝对细胞数量，似乎一致认为pd患者cd3+cd4+t细胞净减少。这种cd4减少得到上述改变的cd4:cd8比率的支持。
106、沿着这些思路，例如，bhatia等(j neuroinflammation(2021)18:250)表明，pd患者cd3+t细胞总数总体减少，这与疾病严重程度有关(例如用h+y分期测量)。这表明，随着疾病的进展，全身t细胞功能障碍会不断加重，这可能反映了持续炎症、药物治疗和生活方式改变的综合影响。此外，lindestam arlehamn等(2020)表明，最高的t细胞活性可在前驱期或早期临床阶段(持续时间<10年，h+y分期0-2)的pd患者中检测到。
107、因此，本发明的优选实施方案是提供用于增加或保持pd患者t细胞数量(尤其是t效应细胞数量)和t细胞功能的治疗。这优选包括多种免疫检查点抑制剂或多种使用抗免疫检查点抑制剂表位的疫苗的组合来诱导抗检查点抑制剂的免疫应答与本发明的靶特异性疫苗组合以增加或保持pd患者t细胞数量(尤其是t效应细胞数量)和t细胞功能。
108、接受/适合治疗的患者的特征是cd3+细胞总体减少，尤其是cd3+cd4+细胞减少，这是pd患者在此病所有阶段的典型特征。对于该组合，定义适合的患者组的优选疾病阶段分别是h+y阶段1-4，优选h+y1-3，最优选h+y 2-3。
109、此类免疫检查点靶向疫苗的例子是提供针对以下的表位的疫苗：细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla-4，登录号p16410)和程序性细胞死亡蛋白1(pd-1，登录号q15116)或其配体、程序性细胞死亡配体1(pd-l1或pd1-l1，登录号q9nzq7)、cd276(登录号q5zpr3)、vtcn1(登录号q7z7d3)、lag3(登录号p18627)或tim3(登录号q8tdq0)；其具有以下氨基酸序列：
110、人ctla4:>sp|p16410|ctla4_uniprot
111、
112、人pd1:>sp|q15116|pdcd1_uniprot
113、
114、人pd1-l1>sp|q9nzq7|pd1l1_uniprot
115、
116、人b7-h3–cd276>sp|q5zpr3|cd276_uniprot
117、
118、人b7-h4–vtcn1>sp|q7z7d3|vtcn1_uniprot
119、
120、人lag3:>sp|p18627|lag3_uniprot
121、
122、人tim3:>sp|q8tdq0|havr2_uniprot
123、
124、靶向ctla-4的抗体以多种方式抑制免疫应答，包括阻碍免疫应答近端步骤(通常在淋巴结中)的自身反应性t细胞活化。相反，pd-1通路在免疫应答的后期(通常在外周组织中)调节t细胞。因此，目前临床上有两种主要的干预方向，即通过靶向ctla-4或pd-1/pd-l1来操纵免疫检查点：抗ctla-4参与抗原特异性t细胞受体活化后的淋巴细胞增殖过程，而抗pd-1/pd-l1主要在效应步骤期间作用于外周组织。然而，ctla-4也在调节性t淋巴细胞上表达，因此参与外周t细胞增殖抑制。
125、如今，数种免疫检查点阻断抗体如伊匹单抗(ipilimumab，抗ctla-4抗体)、纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab)(均为抗pd-1抗体)、阿维单抗(avelumab，抗pd-l1抗体)或阿替利珠单抗(atezolizumab)和度伐单抗(durvalumab)(均为抗b7-h1/pd-l1抗体)可诱导抗癌高免疫力且副作用较小。
126、根据优选实施方案，ctla4蛋白衍生的多肽衍生自天然人ctla4，或为具有一个或多个氨基酸交换的模拟物，形成相应天然序列的模拟表位。
127、根据优选实施方案，pd1蛋白衍生的多肽衍生自天然人pd1或为具有一个或多个aa交换的模拟物，形成相应天然序列的模拟表位。蛋白质序列对应于鼠pd1(q02242；uniprot)和人pd1(q15116；uniprot)的胞外域。
128、根据优选实施方案，pd-l1蛋白衍生的多肽衍生自天然人pd-l1，或为具有一个或多个aa交换的模拟物，从而形成相应天然序列的模拟表位。
129、guo等(br j cancer.2021；125:152-154)和kaumaya等(oncoimmunology.2020；9:1818437)公开了一种pd1衍生肽(aa92-110:gaislapkaqikeslrael)，该肽在有ct26结肠癌细胞的同系balb/c模型中诱导抗体降低肿瘤生长。此外，所述公开的pd1表位疫苗与her-2肽疫苗的组合显示出对结肠癌肿瘤生长的增强抑制作用。
130、tobias等(front immunol.2020；11:895.)公开了来自鼠和人pd-1的肽/模拟表位(＝抗人pd1 mab nivolumab和抗鼠mab克隆29f.1a12的表位)。这些肽包含人pd1衍生序列pgwfldspdrpwnpp、fldspdrpwnpptfs和spdrpwnpptfspa，对应于人pd1的aa21-35、aa24-38和aa27-41位置，分别称jt-n1、jt-n2和jt-n3。此外，鼠pd1的模拟表位包含islhpkakieespga(jt-mpd1)，对应于mpd1的氨基酸残基aa126-140。研究表明，模拟表位jt-mpd1的抗肿瘤作用与所用的表达her-2/neu的同源肿瘤小鼠模型中肿瘤增殖显著减少和凋亡率增加有关。此外，研究表明，当her-2/neu疫苗与jt-mpd1组合时，其抗肿瘤效应增强。
131、chen等(cancers 2019,11,1909)公开了pdl1-vax，一种由人pd-l1(人pd-l1的aa19-220)与t辅助表位序列和人igg1 fc序列连接而成的融合蛋白作为新型pd-l1靶向疫苗。jorgensen等(front immunol.2020；11:595035.)公开了一种源自人pd-l1信号肽的19个氨基酸的肽(fmtywhllnaftvtvpkdl)作为新型pd-l1靶向疫苗。tian等(cancer letters476(2020)170-182)公开了截短的鼠pdl1胞外域(aa19-239)与nitrath表位融合，hpdl1-nitrath也通过将截短的人pdl1胞外域(aa19-238)与nitrath表位融合而构建作为新型pd-l1靶向疫苗。
132、这些抗免疫检查点疫苗单独使用或与现有肽疫苗联合使用时可能非常有效。因此，一种优选实施方案是提供抗免疫检查点疫苗与现有肽疫苗的组合来治疗肿瘤或退行性疾病(如帕金森病)。
133、尽管从原则上讲，本发明能改进所有建议的pd1和pd-l1-相关疫苗多肽，但选定的表位已专门评估过它们与本平台的适用性。例如，seqid no 49/50(gaislapkaqikeslrael)被证明优于klh基疫苗。
134、鉴于本发明偶联物的这些有利特性，本发明的偶联物和疫苗特别适用于主动抗aβ免疫疗法，用于预防、治疗和诊断与β-淀粉样蛋白形成和/或聚集相关的疾病。β-淀粉样变性最突出的形式是阿尔茨海默病(ad)。其他例子包括家族性和散发性ad、家族性和散发性aβ脑淀粉样血管病、遗传性脑出血伴淀粉样变性(hchwa)、路易体痴呆和唐氏综合征痴呆、青光眼中的视网膜神经节细胞变性、包涵体肌炎/肌病。
135、aβ肽以多种形式存在，包括全长aβ1-42和aβ1-40，各种修饰形式的aβ，包括截短的,n端截短的或c端截短的,硝化的,乙酰化的和n截短的种类,焦谷氨酸aβ3-40/42(即aβpe3-40和aβpe3-42)和aβ4-42，它们似乎在神经退行性病变中发挥重要作用。
136、根据优选的实施方案，aβ肽衍生的多肽选自具以下氨基酸序列的天然人aβ1-40和/或aβ1-42：
137、aβ1-40:daefrhdsgy evhhqklvff aedvgsnkga iiglmvggvv
138、aβ1-42:daefrhdsgy evhhqklvff aedvgsnkga iiglmvggvv ia
139、或包含或由人aβ1-40和/或aβ1-42的氨基酸残基组成的多肽，包括截短的，特别是n末端截短的，c末端截短的，翻译后修饰的，硝化，糖基化的，乙酰化的，泛素化的肽氨基酸，或在aa3或aa11处有焦谷氨酸残基的氨基酸或肽，包括aβaa1-6、aa1-7、aa1-8、aa1-9、aa1-10、aa1-11、aa1-12、aa1-13、aa1 -14,aa1-15,aa1-21,aa2-7,aa2-8,aa2-9,aa2-10,aa3-8,aa3-9,aa3-10,aa pe3-8,aa pe3-9、aa pe3-10、aa11-16、aa11-17、aa11-18、aa11-19、aa12-19、aa13-19、aa14-19、aa14-20、aa14-21、aa14-22、aa14-23、aa30-40、aa31-40、aa32-40、aa33-40、aa34-40、aa30-42、aa37-42。
140、根据优选的实施方案，aβ1-40或aβ1-42衍生的多肽选自上述aβ衍生多肽的模拟物，包括模拟表位和含有模拟焦谷氨酸化氨基酸的氨基酸取代的肽。schenk等(nature.1999年7月8日；400(6740)：173-7)公开了aβ1-42作为抗aβ免疫疗法的免疫原，pride等(neurodegenerative dis 2008；5：194-196)公开了与crm197偶联并以qs21为佐剂的aβ1-6肽表位，而wiesner等(j neurosci.2011年6月22日；31(25)：9323-31)公开了与qβ病毒样粒子偶联的aβ1-6肽作为有效的免疫治疗剂。
141、wang等(alzheimer’s&dementia:translational research&clinicalinterventions 3(2017)262-272)和us2018/0244739 a1公开了aβ1-42肽免疫原，尤其是ub311，其包含两种aβ免疫原，即阳离子aβ1-14-εk-kkk-mvf5th[isiteikgvivhrietilf]和aβ1-14-εk-hbsag3 th[kkkiititriitiitid]肽，等摩尔比；将它们与多聚阴离子cpg寡脱氧核苷酸(odn)混合，形成微米级颗粒的稳定免疫刺激复合物，并在最终配方中添加铝矿物盐(adju-phos)。
142、illouz等(vaccine第39卷，第34期，2021年8月9日，第4817-4829页)公开了与hbsag融合的aβ1-11作为老年小鼠的疫苗。
143、davtyan h等(j neurosci.2013年3月13日；33(11):4923-4934)和petrushina等(molecular therapy第25卷第1期153-164)公开了包含两个来自破伤风毒素、p30和p2的外来th细胞表位以及三个拷贝的aβ1-12b细胞表位的疫苗，佐以quila。类似地，davtyan h等(alzheimer's&dementia 10(2014)271–283)公开了建立在蛋白质编码区上的dna基疫苗，由免疫球蛋白(ig)k链信号序列、3拷贝aβ1-11b细胞表位、1个合成肽(padre)和一串8个来自破伤风毒素(tt)(p2、p21、p23、p30和p32)、乙型肝炎病毒(hbsag、hbvnc)和流感(mt)的非自身的混杂型th表位组成，或者还包括3个额外的来自tt的th表位(p7(nysldkiivdynlqskitlp)；p17(linstkiysyfpsviskvnq)；和p28(leyipeitlpviaalsiaes))。
144、petrushina等(journal of neuroinflammation 2008,5:42)公开了具有n端接头(n-caga)的aβ1-28与溴乙酰化酿酒酵母甘露聚糖偶联作为潜在疫苗，但有严重的副作用。
145、us2011/0002949 a1公开了多价疫苗构建体(aβ3-10/aβ21-28)(mvc)和单价疫苗构建体aβ1-8(movc1-8)与载体(klh偶联并与皂苷基佐剂iscomatrix一起施用的。
146、muhs等(proc natl acad sci us a.2007年6月5日；104(23):9810-5)、hickman等(j biol chem.2011年4月22日；286(16):13966-76)和belichenko等(plos one.2016年；11(3):e0152471)公开了aβ1-15作为aβ1-15序列阵列，夹在两端的棕榈酰化赖氨酸之间，其锚定在脂质体表面以使肽采用聚集的β片层结构，形成构象表位。
147、ding等(neuroscience letters，第634卷，2016年11月10日，第1-6页)公开了通过将aβ3-10与免疫原性载体蛋白匙孔血蓝蛋白(klh)偶联或通过将5个aβ3-10表位线性串联而形成的肽。
148、bakrania等(mol psychiatry(2021).https://doi.org/10.1038/s41380-021-01385-7)公开了环化aβ1-14(硫缩醛桥接的aβ肽1-14-klh偶联物；dac*frhdsgyec*hh[cys]-酰胺在完全弗氏佐剂(cfa)中乳化，随后使用在不完全弗氏佐剂(ifa)中乳化的蛋白质加强剂量作为合适的免疫原。
149、lacosta等(alzheimers res ther.2018年1月29日；10(1)：12)公开了aβ肽免疫原，包含aβ1-40短c末端片段的多个重复序列。为了产生免疫应答，这些重复序列与匙孔血蓝蛋白(khl)载体蛋白偶联，并配有佐剂氢氧化铝。
150、axelsen等(vaccine第29卷，第17期，2011年4月12日，第3260-3269页)披露了与匙孔血蓝蛋白偶联的aβ37–42。
151、wo 2004/062556 a2、wo 2006/005707 a2、wo 2009/149486 a2和wo 2009/149485a2公开了aβ表位的模拟表位。结果表明，这些模拟表位能诱导体内形成分别针对未截短的aβ1-40/42和n端截短形式aβpe3-40/42、aβ3-40/42、aβ11-40/42、aβpe11-40/42和aβ14-40/42的抗体。
152、根据优选的实施方案，aβ肽衍生的多肽选自：
153、天然aβ肽
154、
155、模拟表位aβ肽
156、
157、这些抗aβ疫苗单独使用或与针对其他参与β-淀粉样变性、tau蛋白病或突触核蛋白病的病理分子的现有肽疫苗联合使用时非常有效，尤其是混合病理(即存在aβ病理和tau病理和/或asyn病理)。因此，优选的实施方案是提供抗aβ疫苗与抗tau和/或抗asyn肽疫苗的组合，以治疗退行性疾病如阿尔茨海默病、唐氏综合征痴呆、路易体痴呆、帕金森病痴呆、帕金森病或tauo蛋白病。
158、虽然从原则上讲，本发明能改进所有建议的aβ和aβ相关疫苗多肽，但选定的表位与本平台的适用性进行了专门评估。例如，seqid32/33(aβpe3-8；pefrhds)被证明优于klh基疫苗，而seqid10(aβ1-6；daefrh)被证明与不同的clec偶联具有免疫原性。
159、鉴于本发明的偶联物的这些有利特性，本发明的偶联物和疫苗特别适用于主动抗il31疫苗接种，以治疗和预防il31相关疾病及自身免疫性炎症疾病。
160、il31相关疾病包括哺乳动物(包括人类、狗、猫和马)中引起瘙痒的过敏性疾病、引起瘙痒的炎症性疾病和引起瘙痒的自身免疫病。这些疾病包括特应性皮炎、结节性痒疹、牛皮癣、皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)和其他瘙痒性疾病，例如尿毒症性瘙痒、胆汁淤积性瘙痒、大疱性类天疱疮和慢性荨麻疹、过敏性接触性皮炎(acd)、皮肌炎、原因不明的慢性瘙痒症(cpuo)、原发性局限性皮肤淀粉样变性(plca)、肥大细胞增多症、慢性自发性荨麻疹、大疱性类天疱疮、疱疹样皮炎和其他皮肤病，包括扁平苔藓、皮肤淀粉样变性、淤积性皮炎、硬皮病、伤口愈合相关的瘙痒和非瘙痒性疾病，例如过敏性哮喘、过敏性鼻炎、炎症性肠病(ibd)、骨质疏松症、滤泡性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和慢性髓样白血病。
161、根据优选实施方案，单个il31表位可用于触发针对il31不同域的免疫应答。在另一优选实施方案中，多个il31表位的组合可用于触发针对il31不同域(特别是涉及螺旋c或a，以及还涉及螺旋d)的免疫应答，从而阻止il31与il31受体、白介素31受体α(il-31ra)和抑瘤素m受体(osmr)的结合。
162、抗il31疫苗单独使用或与针对引起瘙痒的过敏性疾病、引起瘙痒的炎症性疾病和引起瘙痒的自身免疫病中涉及的其他病理分子的肽疫苗联合使用时，疗效均十分显著。因此，优选的实施方案是提供抗il31疫苗与抗il4和/或抗il13肽疫苗的组合来治疗引起瘙痒的过敏性疾病、引起瘙痒的炎症性疾病和引起瘙痒的自身免疫病。
163、根据优选的实施方案，il31蛋白衍生的多肽是il-31蛋白的片段，和/或优选地选自天然人il31(genbank：aas86448.1；mashsgpstsvlflfcclggwlashtlpvrllrpsddvqkiveelqslskmllkdveeekgvlvsq nytlpclspdaqppnnihspairaylktirqldnksvideiiehldklifqdapetnisvptdthe ckrfiltisqqfsecmdlalksltsgaqqatt)；天然犬il31(genbank:bah97742.1；mlshtgpsrfalfllcsmetllsshmapthqlppsdvrkiilelqplsrglledyqkketgvpesnrtlllcltsdsqpprlnssailpyfrairplsdkniidkiieqldklkfqhepeteisvpadtfecksfiltilqqfsaclesvfkslnsgpq)；天然猫il31(uniprot:a0a2i2ukp7；mlshagparfalfllccmetllpshmapahrlqpsdvrkiilelrpmskgllqdyvskeiglpesn hsslpclssdsqlphingsailpyfrairplsdkntidkiieqldklkfqrepeakvsmpadnfer knfilavlqqfsaclehvlqslnsgpq)；或天然马il31(uniprot f7ahg9mvshigstrfalfllcclgtlmfshtgpiyqlqpkeiqaiivelqnlskkllddyvsaletsilsc ffktdlpscftsdsqapgninssailpyfkaispslnndkslyiieqldklnfqnapetevsmptd nferkrfiltilrwfsnclehraq)或与前述任一有至少70,75,80,85,90或95％序列同一性的任何肽序列，或与天然存在的序列因表面暴露氨基酸的多个点突变而不同的任何肽序列，其中点突变的数目为1、2或3。
164、根据优选的实施方案，il31蛋白衍生的多肽选自上述il31衍生多肽的模拟物，包括模拟表位和含有氨基酸取代的肽。
165、进一步优选的靶序列包括(呈现为线性肽或受约束的肽，例如环化肽或通过合适的aa接头例如ggsgg或类似物而连接的肽)：
166、对于人il31：针对序列aa98-145,aa87-150,aa105-113,aa85-115,aa84-114,aa86-117,aa87-116的衍生肽；或其片段和肽sddvqkiveelqslskmllkdveeekgvlvsqnytl；dvqkiveelqslskmllkdv,eelqslsk和 dvqk, ldnksvideiiehldklifqda；和deiieh,tdtheckrfiltisqqfsecmdlalks,tdtheskrf,tdtherkrf heskrf,herkrf,heckrf；sddvqkiveelq,vqkiveelqsls,iveelqslskml,elqslskmllkd,slskmllkdvee,kmllkdveeekg,lkdveeekgvlv,veeekgvlvsqn,ekgvlvsqnytl,ldnksvideiie,ksvideiiehld,ideiiehldkli,iiehldklifqd,hldklifqdape,klifqdapetni,fqdapetnisvp,apetnisvptdt,tnisvptdthec,svptdtheskrf,tdtheckrfilt,tdtheskrfilt,tdtherkrfilt,heckrfiltisq,heskrfiltisq,herkrfiltisq,krfiltisqqfs,iltisqqfsecm,iltisqqfsesm,iltisqqfserm,isqqfsecmdla,isqqfsesmdla,isqqfsermdla,qfsecmdlalks,qfsesmdlalks,qfsermdlalks,skmllkdveeekg,eelqslsk,kgvlvs,spairaylktirqldnksvideiiehldkli,deiiehldk,svideiiehldkli,spairaylktirqldnksvi,tdtheckrf,heckrfilt,herkrfilt,heskrfilt,svptdtheckrf,svptdtheskrf,和svptdtherkrf
167、对于犬il31：由aa97-144,aa97-133,aa97-122,aa97-114,aa90-110,aa90-144,aa86-144,aa97-149,aa90-149,aa86-149,aa 124-135或其片段组成的肽以及肽：sdvrkiilelqplsrglledyqkketgv,dvrkiilelqplsrglledy elqplsrlsdkniidkiieqldklkfqhe,lsdkniidkiieqldklkfq,klkfqhe,lsdkni,ldkl,lsdkn,adtfecksfiltilqqfsaclesvfks和adnferknf
168、对于猫il31：猫il-31序列的aa124-135和肽sdvrkiilelrpmskgllqdyvskeigl和dvrkiilelrpmskgllqdy,lsdkntidkiieqldklkfqre,adnferknfilavlqqfsaclehvlqs和adnferknf
169、对于马il31：马il-31序列的aa118-129和肽：lqpkeiqaiivelqnlskkllddy,eiqaiivelqnlskkllddy,slnndkslyiieqldklnfq和tdnferkrfiltilrwfsnclehraq
170、对于模拟表位：
171、犬il-31模拟表位包含氨基酸序列svpadtfecksf,svpadtferksf,nssailpyfrairplsdkniidkiieqldklkf,apthqlppsdvrkiilelqplsrg,tgvpes或其变体。
172、猫il-31模拟表位包含氨基酸序列smpadnferknf,ngsailpyfrairplsdkntidkiieqldklkf,apahrlqpsdirkiilelrpmskg,iglpes或其变体。
173、马il-31模拟表位包含氨基酸序列smptdnferkrf,nssailpyfkaispslnndkslyiieqldklnf,gpiyqlqpkeiqaiivelqnlskk,kgvqkf或其变体。
174、人类il-31模拟表位包含氨基酸序列svptdtheckrf,svptdtherkrf,hspairaylktirqldnksvideiiehldklif,lpvrllrpsddvqkiveelqslskm,kgvlvs或其保留抗il-31结合性的变体。
175、根据优选实施方案，il31表位可以是构象表位，包含至少两个氨基酸或氨基酸序列，它们在空间上彼此不同，但非常接近，以形成各自的互补位。互补位通常与抗il31抗体结合，例如，用疫苗接种哺乳动物后获得的特异性识别天然il31的多克隆抗il31抗体。
176、il31是一种具有4个螺旋束结构的蛋白质，如在gp30/il-6细胞因子家族中发现的。il-31的受体是白细胞介素31受体α(il-31ra，也称gpl或gp130样受体)和抑瘤素m受体(osmr)的异二聚体。该异二聚体的两种结构均称为il-31受体或il-31共受体。saux等描述了人il-31与其受体之间的假定相互作用位点(j biol chem 2010,285,3470-34)。靶向il31可通过靶向il-31和/或其受体的抗体实现。开发专门针对il31的专用单克隆抗体，可以在体外和体内对该靶向策略进行临床和临床前验证(front med(lausanne。2021-2-12；8：638325))。
177、bms-981164是一种抗il-31单克隆抗体，靶向循环il-31，由百时美施贵宝公司开发。2012年至2015年期间进行了一项分为两部分的i期单剂量、剂量递增研究，以探索bms-981164(nct01614756)的安全性和药代动力学特征。研究设计为随机、双盲、安慰剂对照，该药物以sc和iv制剂(0.01～3mg/kg)的形式施用于健康志愿者(第1部分)和患有特应性皮炎的成年人(第2部分)。第2部分的成年受试者必须至少患有中度特应性皮炎(由医生总体评估在0～5的范围内评定为_3)，并且瘙痒严重程度在视觉模拟量表上为10分中的至少7分。到目前为止，这项研究尚未公布任何结果。截至2016年，bms-981164已不再列在百时美施贵宝的研发管线中，也没有宣布任何新的试验。
178、us 8,790,651 b2描述了与il-31结合的单克隆抗体，用于治疗免疫疾病，例如特应性皮炎。市场上有一种针对犬il-31的单克隆抗体(lokivetmab，zoetis)，用于治疗犬特应性皮炎。lokivetmab据称会干扰il-31与共受体gpl的结合。
179、ep 4 019 546 a1公开了单特异性和多特异性抗体，所述抗体可变区阻断il-31与il-31受体α(il-31ra)/抑瘤素m受体(osmr)复合物(il-31ra/os-mr复合物)的结合。
180、bachmann等公开了一种利用完整犬il-31与病毒样粒子偶联的疫苗，对狗进行免疫以治疗特应性皮炎。(bachmann,mf；zeltins,a.；kalnins,g.；balke,i.；fischer,n.；rostaher,a.；tars,k.；favrot,c.vaccination against il-31for the treatment ofatopic dermatitis in dogs.j.allergy clin.immunol.2018,142,279-281.e1)。类似地，us11,324,836b2、us11,207,390b2和us10,556,003以及fettelschloss等(doi:10.1111/eve.13408)公开了基于vlp的免疫原，用于靶向来自不同物种(包括人、犬、马或猪il31)的il31和il31相关疾病。这些基于vlp的免疫原的特征是分别具有全长、天然以及全长修饰的il31衍生序列的抗il31免疫原。
181、us2021/0079054a1公开了基于ubith平台技术靶向il31的肽基免疫原，用于治疗和/或预防瘙痒症或过敏症，例如特应性皮炎。沿着这些思路，源自犬il31的基于b细胞表位的免疫原(genbank:bah97742.1；mlshtgpsrfalfllcsmetllsshmapthqlppsdvrkiilelqplsrglledyqkketgvpesn rtlllcltsdsqpprlnssailpyfrairplsdkniidkiieqldklkfqhepeteisvpadtfec ksfiltilqqfsaclesvfkslnsgpq)和人类il31(genbank:aas86448.1；mashsgpstsvlflfcclggwlashtlpvrllrpsddvqkiveelqslskmllkdveeekgvlvsq nytlpclspdaqppnnihspairaylktirqldnksvideiiehldklifqdapetnisvptdthe ckrfiltisqqfsecmdlalksltsgaqqatt)被呈递，包括：
182、对于犬il31：由aa97-144,aa97-133,aa97-122,aa97-114,aa90-110,aa90-144,aa86-144,aa97-149,aa90-149,aa86-149组成的肽；对于人il31：由序列aa98-145,aa87-150,aa105-113,aa85-115,aa84-114,aa86-117,aa87-116衍生的肽，合适时有修改，例如：丝氨酸和半胱氨酸替换。b细胞表位是线性的或受约束的(constrained)，并与混杂型t辅助表位融合，在有佐剂(例如：不同的cpg分子,alhydrogel,adjuphos,montanides如isa50v2、isa51、isa720)存在时配制。
183、us2019/0282704a1公开了用于免疫和/或保护哺乳动物免受il-31介导的疾病的疫苗组合物，其中该组合物包括载体多肽(例如crm197)和il31衍生表位的至少一种模拟表位(选自猫il-31模拟表位、犬il-31模拟表位、马il-31模拟表位或人il-31模拟表位)的组合；以及佐剂。模拟表位可以是线性的或受约束的(例如：环化)。
184、犬il-31模拟表位包含氨基酸序列svpadtfecksf,svpadtferksf,nssailpyfrairplsdkniidkiieqldklkf,apthqlppsdvrkiilelqplsrg,tgvpes或其变体。
185、猫il-31模拟表位包含氨基酸序列smpadnferknf,ngsailpyfrairplsdkntidkiieqldklkf,apahrlqpsdirkiilelrpmskg,iglpes或其变体。
186、马il-31模拟表位包含氨基酸序列smptdnferkrf,nssailpyfkaispslnndkslyiieqldklnf,gpiyqlqpkeiqaiivelqnls kk,kgvqkf或其变体。
187、人类il-31模拟表位包含氨基酸序列svptdtheckrf,svptdtherkrf,hspairaylktirqldnksvideiiehldklif,lpvrllrpsddvqkiveelqslskm,kgvlvs或其保留抗il-31结合性的变体。
188、此外，以(uniprot:a0a2i2ukp7)为代表的猫il-31序列的约aa124-135之间的区域；以(genbank:bah97742.1)为代表的犬il-31序列的约aa124-135之间的区域；以及以(uniprot f7ahg9)为代表的马il-31序列的约aa118-129之间的区域被公开为合适的表位。
189、wo 2019/086694 a1公开了靶向il31的肽基免疫原，其通过包含未包装的il31螺旋肽的il31抗原实现，或其中包含来自犬、人、猫、马、猪、牛或骆驼科动物il31的表位。抗原与常规载体分子(例如：klh)偶联并用imject alum佐剂，或可与可能含有tlr9激动剂cpg或tlr7/8激动剂咪唑喹啉的抗cd32scfv构建体偶联。具体地，il31肽包含或由以下任一氨基酸序列组成螺旋a:
190、人:sddvqkiveelqslskmllkdveeekgvlvsqnytl；和dvqkiveelqslskmllkdv,eelqslsk和dvqk
191、犬:sdvrkiilelqplsrglledyqkketgv,和dvrkiilelqplsrglledy和elqplsr
192、猫:sdvrkiilelrpmskgllqdyvskeigl和dvrkiilelrpmskgllqdy
193、马:lqpkeiqaiivelqnlskkllddy和eiqaiivelqnlskkllddy
194、螺旋c
195、人:ldnksvideiiehldklifqda；和deiieh
196、犬:lsdkniidkiieqldklkfqhe,lsdkniidkiieqldklkfq,klkfqhe,lsdkni,ldkl,lsdkn,
197、猫:lsdkntidkiieqldklkfqre
198、马:slnndkslyiieqldklnfq
199、和/或螺旋d:
200、人:tdtheckrfiltisqqfsecmdlalks,tdtheskrf和heskrf
201、犬:adtfecksfiltilqqfsaclesvfks和adnferknf
202、猫:adnferknfilavlqqfsaclehvlqs和adnferknf
203、马:tdnferkrfiltilrwfsnclehraq
204、可以单独或组合使用，也可以使用所公开的接头序列融合。
205、wo 2022/131820 a1公开了免疫调节或抗炎il31衍生肽作为药物或化妆品中预防或治疗特应性皮炎的活性成分。本发明还公开了il31肽或其片段与生物相容性聚合物偶联的偶联物，所述生物相容性聚合物例如：普鲁兰多糖(pullulan)、硫酸软骨素、透明质酸(ha)、乙二醇壳聚糖、淀粉、壳聚糖、葡聚糖、果胶、卡德兰胶、聚-l-赖氨酸、聚天冬氨酸(paa)、聚乳酸(pla)、聚乙二醇交酯(聚乙醇酸交酯，pga)、聚己内酯(聚(ε-己内酯)，pcl)、聚(己内酯-丙交酯)无规共聚物(pcla)、聚(己内酯-乙醇酸交酯)无规共聚物(pcga)、聚(丙交酯-乙醇酸交酯)无规共聚物(plga)、聚乙二醇(peg)、普卢兰尼克(pluronic)f-68和普卢兰尼克f-127(pluronic f-127)或脂肪酸，例如：己酸(hexanoic acid)、辛酸(caprylicacid，c8)、癸酸(capric acid，c10)、月桂酸(lauric acid，c12)、肉豆蔻酸(myristicacid，c14)、棕榈酸(c16)、硬脂酸(c18)和胆固醇(cholesterol)以增加肽的稳定性和皮肤渗透性。肽或偶联物不建议作为本文中的免疫原。
206、虽然原则上，本发明能改进所有建议的il31相关疾病疫苗多肽，但选定的表位(参见seqids)已专门评估了其与crm197基疫苗相比对本平台的适用性。
207、选定的序列
208、·seqid132 skmllkdveeekg-nhnh2 seqid133 skmllkdveeekg-c
209、·seqid134 eelqslsk-nhnh2；seqid135 eelqslsk-c；
210、·seqid136 kgvlvs-nhnh2；seqid137 kgvlvs-c；
211、·seqid138 svideiiehldkli-nhnh2；seqid139 svideiiehldkli-c；
212、·seqid140 spairaylktirqldnksvi-nhnh2；seqid141
213、spairaylktirqldnksvi-c；
214、·seqid142 herkrfilt-nhnh2；seqid143 herkrfilt-c；
215、·seqid144 heskrfilt-nhnh2；seqid145 heskrfilt-c；
216、·seqid146 svptdtherkrf-nhnh2,seqid147 svptdtherkrf-c
217、·seqid148 svptdtheskrf-nhnh2,seqid149 svptdtheskrf-c
218、·seqid150 krfiltisqqfs-nhnh2 seqid151 krfiltisqqfs-c
219、鉴于本发明偶联物的这些有利特性，本发明的偶联物和疫苗特别适用于降钙素基因相关肽(cgrp)相关疾病的主动免疫治疗。
220、cgrp相关疾病选自发作性和慢性偏头痛和丛集性头痛、痛觉过敏、功能障碍性疼痛状态下的痛觉过敏，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、内脏痛过敏综合征、纤维肌痛、炎症性肠综合征、神经性疼痛、慢性炎症性疼痛和头痛。
221、根据优选实施方案，cgrp衍生多肽衍生自天然人cgrpα(acdtatcvthrlagllsrsggvvknnfvptnvgskaf；降钙素异构体α-cgrp前体蛋白之aa83-119的一段37aa肽片段，登录号np_001365879.1)或天然人cgrpβ的aa82-228(acntatcvthrlagllsrsggmvksnfvptnvgskaf；降钙素基因相关肽2前体的aa82-118的一段37aa肽片段，登录号np_000719.1)或其前体分子(np_001365879.1和np_000719.1)。cgrp衍生的多肽还可以是有一个或多个氨基酸交换的模拟物，形成相应天然序列的模拟表位。
222、根据优选的实施方案，cgrp衍生的多肽选自天然人cgrp的功能位点，包括cgrp的中心区(例如aa8-35)或其片段、c末端cgrp受体结合区(例如：aa11-37)或其片段或可能还包含cgrp内的环状c2-c7环的n末端区域(例如aa1-20)或其由源自这些位点的氨基酸残基组成的片段或模拟表位。
223、进一步优选的靶序列包括acdtatcvth；acdtatcvthrlagl；acdtatcvthrlagllsr；acdtatcvthrlagllsrsg；acdtatcvthrlagllsrsggvvkn；tatcvthrlagll；atcvthrlagllsr；rlagllsr；rlagllsrsggvvkn；rsggvvkn；rlagllsrsggvvknnfvpt；rlagllsrsggvvknnfvptnvg；rlagllsrsggvvknnfvptnvgsk；rlagllsrsggvvknnfvptnvgskaf；llsrsggvvknnfvptnvgskaf；rsggvvknnfvptnvgskaf；ggvvknnfvptnvgskaf；vvknnfvptnvgskaf；nnfvptnvgskaf；vptnvgskaf；nvgskaf；gskaf
224、在us2022/0073582 a1中，公开了多肽构建体含有cgrp衍生的肽aa1-10acdtatcvth；aa 1-15acdtatcvthrlagl；aa 1-18acdtatcvthrlagllsr；aa 1-20acdtatcvthrlagllsrsg；aa 1-25acdtatcvthrlagllsrsggvvkn；aa4-16tatcvthrlagll；aa 5-18atcvthrlagllsr；aa 11-18rlagllsr；aa11-25rlagllsrsggvvkn；aa 11-30rlagllsrsggvvknnfvpt；aa 11-33rlagllsrsggvvknnfvptnvg；aa 11-35rlagllsrsggvvknnfvptnvgsk；aa 11-37rlagllsrsggvvknnfvptnvgskaf；aa 15-37llsrsggvvknnfvptnvgskaf；aa18-37rsggvvknnfvptnvgskaf；aa 20-37ggvvknnfvptnvgskaf；aa 22-37vvknnfvptnvgskaf；aa 25-37nnfvptnvgskaf；aa 28-37vptnvgskaf；aa31-37nvgskaf；天然人cgrp(登录号：np_001365879.1)具有以下氨基酸序列：mgfqkfspflalsilvllqagslhaapfrsalesspadpatlsedearlllaalvqdyvqmkasel eqeqeregsriiaqkracdtatcvthrlagllsrsggvvknnfvptnvgskafgrrrrdlqa。us 2022/0073582a1中公开的肽免疫原构建体需要cgrp衍生的b细胞表位与一个或多个混杂型t细胞表位偶联，以发挥靶向gcrp的肽免疫原构建体的功能。
225、除了主动免疫疗法外，人源化抗降钙素基因相关肽(cgrp)单克隆抗体已被建议作为抗cgrp靶向范例。已发现抗体可有效降低慢性偏头痛的发病频率(dodick dw等(2014)lancet neurol.13:1100-1107；dodick dw等(2014)lancet neurol.13:885-892；bigal me等(2015)lancet neurol.14:1081-1090；bigal me等(2015)lancet neurol.14:1091-1100；和sun h等(2016)lancet neurol.15:382-390)。
226、沿着这些思路，us 8,597.649b2、ep 1957106 b1和us 9.266,951b2公开了临床使用的靶向人cgrp内aa25-37和/或aa33-37的单克隆抗体，用于治疗偏头痛、丛集性头痛和紧张性头痛。us20120294797 a1公开了临床使用的靶向cgrp的单克隆抗体，根据共结晶结果，其也特异于c端表位aa26-37(https://doi.org/10.1080/21655979.2021.2006977)，表明该表位适合免疫疗法。us 9,505,838b2还公开了针对cgrp的临床使用的单克隆抗体，其与具有cgrp aa25-37的c端片段结合或与cgrp aa25-37内的c端表位结合。
227、尽管原则上本发明能改进所有建议的cgrp相关疾病疫苗多肽，但专门对所选表位(见seqid 152～seqid162)与本平台的适用性通过与crm197基疫苗相比进行了评估。
228、选定进行实验的序列：
229、·seqid152 rlagllsr-nhnh2,seqid153 rlagllsr-c
230、·seqid154 rlagllsrsggvvkn-nhnh2,seqid155 rlagllsrsggvvkn-c
231、·seqid156 rsggvvkn-nhnh2,seqid157 rsggvvkn-c
232、·seqid158 nnfvptnvgskaf-nhnh2,seqid159 nnfvptnvgskaf-c
233、·seqid160 vptnvgskaf-nhnh2,seqid161 vptnvgskaf-c
234、·seqid162 nvgskaf-nhnh2,seqid163 nvgskaf-c
235、鉴于本发明的偶联物的这些有利特性，本发明的clec基偶联物和clec基疫苗特别适用于治疗ige介导的i型过敏性疾病的特异性过敏原免疫疗法(ait)。过敏性疾病通常是指由免疫系统对环境中通常无害的物质的超敏反应引起的多种疾病。这些疾病包括但不限于花粉症,季节性-、食物-、花粉-、霉菌孢子-、有毒植物-、医疗/药物-、昆虫-、蝎子-或蜘蛛-毒液、乳胶-或灰尘过敏,宠物过敏,过敏性支气管哮喘,过敏性鼻炎和-结膜炎,特应性皮炎,针对粘合剂、抗菌剂、香料、染发剂、金属、橡胶成分、外用药物、松香、蜡、抛光剂、水泥和皮革的接触性皮炎,慢性鼻窦炎,特应性湿疹,ige发挥作用的自身免疫病(“自身过敏”),慢性(特发性)和自身免疫性荨麻疹,重度过敏反应，尤其是特发性和运动诱发的重度过敏反应。
236、迄今为止，特异性ait是过敏的唯一治愈性方法，通过反复注射含有不同来源(如食物、花粉、动物皮屑、螨虫或昆虫毒液)提取物的过敏原来实现。然而，目前临床实践中使用的特异性ait模式的特点是治疗期很长、需要频繁注射、疗效有限，这些因素共同导致患者依从性低(musa等，hum vaccin immunother.2017年3月；13(3):514–517。doi:10.1080/21645515.2016.1243632)。
237、ait的主要机制是诱导所谓的阻断抗体，最好是igg4同种型，但也可以是其他同种型(例如igg1或iga)。研究表明，天然存在的iga和igg靶向过敏原表面上与ige特异性识别的表位(所谓ige表位)不同的表位(shamji,valenta等2021；allergy 76(12):3627-3641)。而ige表位是负责通过高亲和力fcεri受体与肥大细胞结合的ige交联，由此诱导速发型过敏免疫应答。
238、相比之下，ait诱导的阻断抗体(主要为igg-和iga-型)是针对这些ige表位。它们与过敏原的结合干扰细胞结合型ige的交联，从而抑制过敏反应的引发。igg4表现出作为阻断抗体的良好特性，因为它不能交联过敏原，且用于激活igg fc受体(fcγr)的亲和力较低，同时对fcγriib保持高亲和力。这些特性使igg4成为ige依赖性反应的有效抑制剂，而不会引起与igg免疫复合物形成和补体激活相关的不良炎症(shamji,valenta等，2021年)。然而，igg4的阻断能力不一定优于其他igg亚类{ejrnaes等，2004年；molecularimmunology第41卷,第5期,2004年,第471-478页}，特别是ait阻断活性早期也由其他igg类型(尤其igg1)赋予(strobl,demir等2023年,journal of allergy and clinicalimmunology doi:10.1016/j.jaci.2023.01.005)。
239、根据优选实施方案，单个过敏原表位可用于触发针对相应过敏原(例如表a和b中提到的ige表位)的免疫应答。在另一优选实施方案中，来自一种过敏原的多个表位的组合可用于触发针对过敏原不同域的免疫应答。
240、这些抗单一过敏原的疫苗单独使用或与针对其他牵涉过敏性疾病的过敏原分子的肽疫苗联合使用时效果均十分显著。因此，一种优选实施方案是提供不同过敏原的表位的组合以触发针对不同过敏原的免疫应答。
241、根据优选的实施方案，过敏原衍生的多肽是过敏原蛋白(尤其表a和b所示)的片段，和/或优选选自天然蛋白质(尤其是表a和b所列)。
242、根据优选的实施方案，过敏原衍生的多肽是过敏原蛋白的线性片段，包括表a和b中描述的那些。
243、根据优选的实施方案，过敏原衍生的多肽选自上述过敏原衍生多肽的模拟物，包括模拟表位和含有氨基酸取代的肽。
244、根据优选的实施方案，过敏原衍生的多肽衍生自天然过敏原，或者是具有一个或多个氨基酸交换的模拟物，从而形成相应天然序列的模拟表位。
245、根据优选实施方案，过敏原表位可以是构象表位，包含至少两个氨基酸或氨基酸序列，它们在空间上彼此不同，但非常接近，以形成各自的互补位。互补位通常与抗过敏原抗体结合，例如，在用疫苗接种哺乳动物后获得的特异性识别天然过敏原的多克隆抗过敏原抗体。
246、根据优选实施方案，相应的构象表位或模拟表位可以从文献中获得或用预测算法(如见：dall'antonia和keller 2019，nucleic acids research 47(w1):w496-w501)或公共数据库(例如：https://www.iedb.org/)识别。用于本发明的潜在靶抗原及其相应表位/模拟表位的选定示例见表a和b。
247、根据优选实施方案，进一步优选的靶序列包括受约束的肽，例如环化肽或通过本领域技术人员已知的合适aa接头(例如：(g)n接头、(k)n接头、ggsgg或类似物)连接的肽。
248、表a–clec疫苗中使用的首选过敏原
249、
250、
251、
252、
253、
254、表b：用于clec基疫苗的首选过敏原表位
255、
256、
257、
258、
259、
260、
261、ait的积极结果与诱导能中和过敏原的高亲和力igg抗体有关(svenson,jacobi等2003,molecular immunology 39(10):603-612；zha,leoratti等2018,journal ofallergy and clinical immunology 142(5):1529-1536.e1526)。然而，在经典ait期间，诱导的阻断igg的初始亲合力不会随着时间进一步增加(strobl等2023；jakobsen cg等,2005，clinical&expeimental allergy，35：193-198。doi：10.1111/j.1365-2222.2005.02160.x)，这支持以下观点：ait诱导的对过敏原与ige结合的抑制可以主要或仅通过诱导特异性igg的增加量来解释(svenson等,2003,molecular immunology 39(10)：603-612；jakobsen等,2005)。因此，人们认为，传统ait的成功率相当有限，主要原因是现有ait化合物的免疫原性较低，并且在长期ait应用后缺乏进一步的亲合力成熟。
262、相反，本发明的疫苗或偶联物特别适合于ait和对高亲合力igg的所需诱导，因为它们诱导具有更高抗体水平的ige-表位特异性免疫应答(作为常规疫苗)，其在重复免疫后显示出延长的亲和力成熟(参见例如图13和图21)。这导致比包括佐以alum的疫苗和偶联疫苗(有和没有佐剂)在内的传统疫苗有更高亲合力的免疫血清。
263、目前，ait仅使用天然来源的过敏原提取物，其代表过敏原和非过敏原蛋白、糖蛋白和多糖的复杂异质混合物(cox等2005，expert review of clinical immunology 1(4):579-588.)。所得产品难以标准化，并且可能引起不良副作用，包括重度过敏反应和基于t细胞的晚期应答(mellerup、hahn等2000，experimental allergy 30(10):1423-1429)。
264、因此，临床开发中的新型疫苗概念利用提供通用t细胞辅助的平台(类病毒颗粒{shamji，2022#14}或载体蛋白如klh或肝炎pres融合蛋白(marth等2013，journal ofimmunology 190(7):3068-3078)和重组过敏原蛋白或肽(包含过敏原表位或其模拟表位)以增加免疫原性和亲和力成熟(bachmann等，2020，trends in molecular medicine 26(4):357-368)。
265、后一种方法应用包含过敏原表位或其模拟表位的肽-载体偶联物，这对于患者的新型ait模式尤其有利，因为它将免疫应答集中在所需靶表位(即ige表位)，并完全避免直接副作用(即疫苗与细胞结合型ige的交联)以及晚期副作用(即激活过敏原特异性t细胞应答)。
266、marth等(2013)公开了在两种非过敏性肽pa和pb的融合蛋白基础上的ait化合物，这两种肽源自主要桦树花粉过敏原bet v 1的ige反应区，它们与乙肝表面蛋白pres融合，形成含有不同数量和不同组合的肽的四种重组融合蛋白。同样，被临床测试的ait疫苗bm32使用了4种融合蛋白，由4种主要梯牧草花粉过敏原(phl p 1、phl p 2、phl p 5和phl p 6)的肽组成，与乙肝的pres载体蛋白融合。weber等(2017；doi:10.1016/j.jaci.2017.03.048)证明alum为佐剂的bm32和传统的提取物介导的ait在兔子中具有相似的免疫原性。然而，尽管最初的临床结果令人鼓舞(eckl-dorna，2019ebiomedicine。2019年12月；50:421-432。doi:10.1016/j.ebiom.2019.11.006.)，但bm32方法的进一步开发在iib期研究后被放弃。到目前为止，还没有肽-载体偶联物或融合蛋白ait方法，也没有任何其他用于ait的新型重组疫苗获得许可(pavón-romero，2022，cells.2022年1月8日；11(2):212。doi:10.3390/cells11020212)。
267、沿着这些思路，已经证明，对过敏患者单次注射针对主要猫过敏原fel d 1内两个表位的两种单克隆抗体与多年的传统ait相比同样有效(orengo,radin等，2018，naturecommunications 9(1):1421)，这表明给定过敏原内的少量靶表位可能足以提供来自过敏免疫应答的全面保护。本发明的疫苗或偶联物特别适合将通用t细胞表位与clec骨架上的此类ige表位或模拟表位组合以治疗过敏症。
268、虽然从原则上讲，本发明能改进所有建议的过敏性疾病疫苗多肽，但选定的表位(见表a和b以及seqid45/46)是特别优选的。例如，seqid45/46被证明优于klh基疫苗。
269、鉴于本发明偶联物的这些有利特性，本发明的clec基偶联物和clec基疫苗特别可用于增强市售肽/糖-偶联物疫苗(尤其是用于预防传染病的糖偶联物疫苗)的免疫原性。此类疾病例如是微生物感染或病毒感染，例如由乙型流感嗜血杆菌(hib)、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌和伤寒沙门氏菌或其他传染源，包括引起甲型或乙型肝炎、人乳头瘤病毒感染、流感、伤寒、麻疹、腮腺炎和风疹的传染源引起的感染。此外，还有由b组脑膜炎球菌、巨细胞病毒(cmv)、呼吸道合胞病毒(r sv)、艰难梭菌、肠外致病性大肠杆菌(expec)、肺炎克雷伯氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫、冠状病毒(sars-cov、mers-cov、sars-cov-2)、埃博拉病毒、伯氏疏螺旋体、hiv等引起的感染。
270、迄今为止，已获许可的偶联疫苗中使用了几种载体蛋白：白喉毒素经遗传修饰的交叉反应材料(crm197)、破伤风类毒素(tt)、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(ompc)、白喉类毒素(dt)、流感嗜血杆菌蛋白d(hid)和重组铜绿假单胞菌外毒素a(repa)。临床试验已证明这些偶联疫苗在预防传染病和改变乙型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌和伤寒传播方面的效力。所有载体蛋白均能有效提高疫苗的免疫原性，但它们引发的抗体数量和亲合力、在同一产品中携带多种多糖的能力以及与其他疫苗同时接种的能力各不相同。
271、根据优选实施方案，适合进行clec修饰和增强免疫原性的偶联疫苗包括但不限于现有疫苗，包括乙型嗜血杆菌偶联疫苗(例如：)、重组乙肝疫苗(例如：recombivax )、人乳头瘤病毒疫苗(例如：gardasil)、脑膜炎球菌(a、c、y和w-135群)寡糖白喉crm197偶联疫苗(例如)、脑膜炎球菌(a、c、y和w-135群)多糖白喉类毒素偶联疫苗(例如：)、脑膜炎球菌(a、c、y、w群)tt-偶联疫苗(例如：)、多价肺炎球菌偶联疫苗(例如：prevnar)、抗伤寒疫苗(例如：typhimtyphimvi多糖结合至无毒性重组铜绿假单胞菌外毒素a、或vi-repa或多糖破伤风类毒素偶联疫苗)、水痘-带状疱疹病毒疫苗(例如)以及其他抗感染偶联疫苗，它们携带白喉毒素经遗传修饰的交叉反应物质(crm197)、破伤风类毒素(tt)、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(ompc)、白喉类毒素(dt)、流感嗜血杆菌蛋白d(hid)或重组铜绿假单胞菌外毒素a(repa)作为载体分子。
272、根据另一方面，本发明的新型偶联物可用于预防传染病。此类疾病例如是微生物感染或病毒感染，例如由乙型流感嗜血杆菌(hib)、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌和伤寒沙门氏菌或其他感染因子，包括引起甲型或乙型肝炎、人乳头瘤病毒感染、流感、伤寒、麻疹、腮腺炎和风疹的感染因子引起的感染。还有由b组脑膜炎球菌、巨细胞病毒(cmv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、艰难梭菌、肠外致病性大肠杆菌(expec)、肺炎克雷伯氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、疟原虫、冠状病毒(sars-cov、mers-cov、sars-cov-2)、埃博拉病毒、伯氏疏螺旋体、hiv等引起的感染。
273、虽然从理论上讲，本发明可以改进所有建议的抗感染偶联疫苗，但具体分析了选定的疫苗。例如，clec改良的脑膜炎球菌(a、c、y和w-135组)寡糖白喉crm197偶联疫苗(即)和乙型嗜血杆菌偶联疫苗被证明优于市售的和疫苗。
274、鉴于本发明偶联物的这些有利特性，本发明的偶联物和疫苗特别适用于前蛋白(proprotin)转化酶枯草溶菌素/kexin 9型(pcsk9)相关疾病的主动免疫治疗，包括但不限于高脂血症、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)血清水平升高和心血管事件、中风或各种形式的癌症。
275、根据优选实施方案，pcsk9蛋白衍生的多肽是源自天然人pcsk9(登录号：q8nbp7)并具有以下氨基酸序列：
276、
277、或其片段，或为有一个或多个氨基酸交换的模拟物，形成相应天然序列的模拟表位。进一步优选的靶序列包括线性肽或受约束(例如环化)的肽或由合适的氨基酸接头(例如：ggsgg或类似物)连接的肽。
278、根据优选的实施方案，pcsk9蛋白衍生的多肽选自以下区域：aa150-170、aa153-162、aa205-225、aa211-223、aa368-382，或者包含或由源自这些亚基的氨基酸残基或模拟表位组成的多肽。
279、根据优选实施方案，所述pcsk9蛋白衍生的多肽选自pcsk9衍生的序列：nvpeedgtrfhrqask,nvpeedgtrfhrqaskc,peedgtrfhrqask,cpeedgtrfhrqask,peedgtrfhrqaskc,aeedgtrfhrqask,teedgtrfhrqask,pqedgtrfhrqask,peedgtrfhrrask,peedgtrfhrkask,peedgtrfhrqasr,peedgtrfhrtask,sipwnleritppr,peedgtrfhrqask,peedgtrfhrqa,eedgtrfhrqask,eedgtrfhrqas,sipwnleritp,sipwnleritpc,sipwnlerit,sipwnleritc,lrprgqpnqc,srhlaqasq,srhlaqasqc,srsgkrrger,srsgkrrgerc,iigassdcstcfvsq,iigassdsstsfvsq,iigassdsstsfvsqc,cigassdsstsfvsc,igassdsstsfvsc,cdgtrfhrqaskc,dgtrfhrqaskc,cdgtrfhrqask,agrdagvakgac,rdagvakc,rdagvak,srhlaqasqleqc；srhlaqasqleq,gdyeelvlalrc；gdyeelvlalr,lvlalrseedc；lvlalrseed,akdpwrlpc；akdpwrlp,aarrgyltkc, aarrgyltk,flvkmsgdllelalklpc；flvkmsgdllelalklp,eedssvfaqc,eedssvfaq,nvpeedgtrfhrqaskc, nvpeedgtrfhrqask,cksaqrhfrtgdeepvn,ksaqrhfrtgdeepvn,
280、根据优选实施方案，单个pcsk9衍生表位可用于触发针对pcsk9的3个不同域(即抑制性前域(aa1-152)、催化域(aa153-448)和c末端域(449-692))内不同区的免疫应答。在另一优选实施方案中，pcsk9衍生表位的组合可用于触发针对pcsk9各域内不同表位的免疫应答，尤其涉及催化域(aa153-449)，进一步涉及抑制性前域(aa1-152)和/或c末端域(449-692)。
281、血管疾病如高血脂症、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠心病和中风是全球主要死亡原因之一，而ldl-c水平升高是它们的发病机制中的关键因素。因此，ldl-c管理是成功治疗高脂血症、高胆固醇血症和动脉粥样硬化的一个非常重要的因素。相应地，pcsk9通过直接作用于ldlr而在ldl分解代谢中起着至关重要的作用。抑制pcsk9对ldl-c水平有益。因此，抗pcsk9疗法在有益调节ldl-c水平和治疗pcsk9相关疾病方面是一种有前途的方法。
282、wo2015128287a1和ep2570135a1公开了pcsk9模拟表位载体偶联疫苗(例如：klh或crm197作为载体)，并公开了peedgtrfhrqask,aeedgtrfhrqask,teedgtrfhrqask,pqedgtrfhrqask,peedgtrfhrrask,peedgtrfhrkask,peedgtrfhrqasr,peedgtrfhrtask以及pcsk9的aa150-170和/或aa205-225序列，尤其是sipwnleritppr,peedgtrfhrqask,peedgtrfhrqa,eedgtrfhrqask,eedgtrfhrqas,sipwnleritp和sipwnlerit。
283、cn105085684a公开了包含pcsk9表位和白喉毒素dtt的重组疫苗。该表位肽与载体蛋白白喉毒素跨膜结构域dtt的c末端连接。cn106822881a公开了以重组pcsk9蛋白片段多肽(催化域和c末端域)为特征的蛋白疫苗。
284、wo2022150661a2公开了用于pcsk9免疫疗法的病毒(包括噬菌体病毒或植物病毒)或病毒样粒子，尤其是包含pcsk9衍生序列nvpeedgtrfhrqaskc。
285、ep3434279a1公开了一种osk-1-pcsk9偶联疫苗；使用pcsk9衍生序列lrprgqpnqc,srhlaqasq和srsgkrrger。wo2021/154947a1；公开了基于ubith技术的抗pcsk9免疫原，即包含与混杂t细胞表位融合的pcsk9表位的偶联疫苗。公开的序列包括aa153-162、aa368-382、aa211-223和sipwnlerit,cigassdsstsfvsc,cdgtrfhrqaskc。
286、wo2011/027257a2和wo 2012/131504 a1：公开了靶向pcsk9的pcsk9衍生肽-vlp和pcsk9衍生肽-载体疫苗，包括序列sipwnleritpc,sipwnleritc,sipwnleritp,agrdagvakga,rdagvak；srhlaqasqleq；gdyeelvlalr；lvlalrseed；akdpwrlp-；aarrgyltk；flvkmsgdllelalklp；eedssvfaq。wo2015/123291a1：公开了靶向pcsk9的肽-vlp(qb)疫苗，包含序列：nvpeedgtrfhrqaskc和cksaqrhfrtgdeepvn，而wo2018/189705公开了基于序列sipwnleritpc及其修饰的衍生物的靶向pcsk9的肽-载体偶联物。
287、本发明优选的多肽免疫原构建体包含来自α-突触核蛋白的b细胞表位和与clec偶联的异源t辅助细胞(th)表位。本发明提供了令人惊讶的优越的新偶联物，其在免疫原性、对α-突触核蛋白的交叉反应性、对α-突触核蛋白种类/聚集体的选择性、亲和力、亲合力成熟和抑制能力方面均超越了传统疫苗。
288、α突触核蛋白多肽与β-葡聚糖或甘露聚糖根据本发明的共价偶联能意外增强对此类多肽的免疫应答。这一点在与传统疫苗制剂，如rockenstein等所述(j.neurosci.,2018年1月24日·38(4):1000-1014)直接比较时尤其令人印象深刻，也如下面示例部分所示。
289、rockenstein等(2018)披露了应用酵母葡聚糖全粒子(gp)与asyn和雷帕霉素非共价复合作为帕金森病免疫治疗剂。这些gp是从酿酒酵母经一系列热碱、有机和水性提取步骤后产生的，最终产品由高度纯化的直径3-4微米的酵母细胞壁制剂组成，不含胞质内容物，并被多孔、不溶性β-葡聚糖(主要是β1-3β-葡聚糖)在外包裹。
290、重要的是，rockenstein等(2018)公开的疫苗组合物由gp与卵清蛋白和小鼠血清白蛋白(msa)、人asyn和msa或人asyn、msa和雷帕霉素非共价复合组成。该复合方法依赖于不同有效载荷与gp的共孵育，随后扩散到空心gp腔中而不进行共价连接，因此类似于本技术实施例28的一组疫苗，仅使用多组分的混合而非共价连接来配制疫苗，被证明比本发明的疫苗低效和不合适。
291、1)rockenstein等表明，asyn和gp的非共价混合导致可检测到的抗asyn免疫应答，因此表明gp可充当佐剂。然而，rockenstein等还表明，与对照相比，雷帕霉素的非共价添加/共-复合是诱导此类疫苗相比对照功能显著增强所必需的。从这个角度来看，需要混合各种佐剂(gp以及mtor抑制剂雷帕霉素)才能提供功能齐全的疫苗，例如本发明公开的疫苗。
292、2)rockenstein等公开的疫苗在这种asyn过度表达模型中是活跃的，因为它提供了asyn特异性t细胞表位(以及其他t细胞表位，如msa衍生表位)，以发挥其全部功能，即诱导神经保护性、抗asyn定向细胞性(即：t细胞介导)和体液性(即基于抗体/b细胞)免疫应答。这与本发明的教导完全相反，在本发明的教导中，仅仅asyn特异性b细胞应答被所选疫苗引发就足够了。
293、3)使用全长asyn还存在诱发/增强自身反应性asyn特异性t细胞的危险，这种t细胞有可能加剧pd和其他突触核病的潜在神经病理学。因此，就此问题而言，rockenstein等提出的gp-asyn-雷帕霉素疫苗也不适合人类使用。
294、4)如实施例5所示，与rockenstein等类似，将asyn衍生肽(例如seqid2，即b细胞表位)和混杂t细胞表位(例如seqid7)与β-葡聚糖粒子(例如未氧化的石耳聚糖)非共价混合也能诱导低水平的抗asyn抗体应答。然而，本发明基于此类肽与合适葡聚糖共价连接的疫苗产生明显不同且更优的免疫应答(也见图5)。
295、此外，实施例6和图7还公开了，与本发明公开的基于葡聚糖粒子和肽的非共价混合疫苗相比，这种共价连接的疫苗还表现出非常有益的抗葡聚糖抗体应答的缺失。
296、因此，rockenstein等的现有技术并未暗示本发明公开的所要求保护的主题。
297、本发明中要偶联的特别优选的asyn多肽选自天然α-突触核蛋白，或包含或由天然人α-突触核蛋白的以下氨基酸残基组成的多肽：1-5,1-8,1-10,60-100,70-140,85-99,91-100,100-108,102-108,102-109,103-129,103-135,107-130,109-126,110-130,111-121,111-135,115-121,115-122,115-123,115-124,115-125,115-126,118-126,121-127,121-140或126-135：mdvfmkglsk akegvvaaae ktkqgvaeaa gktkegvlyv gsktkegvvhgvatvaektk eqvtnvggav vtgvtavaqk tvegagsiaa atgfvkkdql gkneegapqe giledmpvdpdneayempse egyqdyepea(人asyn(1-140aa)：uniprot登录号p37840)，
298、优选地，包含或由以下氨基酸残基组成的多肽：1-8,91-100,100-108,103-135,107-130,110-130,115-121,115-122,115-123,115-124,115-125,115-126,118-126,121-127或121-140；或选自dqpvlpd,dqpvlpdn,dqpvlpdne,dqpvlpdnea,dqpvlpdneay,dqpvlpdneaye,dspvlpdg,dhpvhpds,dtpvlpds,dapvtpdt,dapvrpds,和ydrpvqpdr的模拟表位。
299、现有clec疫苗均能诱导针对所用载体蛋白(例如crm197或ova)的高滴度。然而，这种高免疫原性以及载体蛋白成分的结构复杂性和异质性可能导致诱导高水平的载体/蛋白特异性抗体，而牺牲靶标特异性应答，因此与诱导的载体应答相比，靶标特异性应答的代表性可能不足。
300、此外，由于偶联物中载体特异性表位的过度表达，用载体偶联物重复免疫诱导的靶标特异性应答的亲和力成熟也受损。本文所用和所理解的免疫学亲和力成熟是免疫应答过程中被tfh细胞激活的b细胞产生对抗原有更高亲和力的抗体的过程。通过反复接触相同抗原，宿主将产生亲和力逐渐增强的抗体。二次应答可引发亲和力比初次应答高出数倍的抗体。亲和力成熟主要发生在生发中心b细胞的表面免疫球蛋白上，是体细胞超变(shm)和tfh细胞选择的直接结果(亦见：https://en.wikipedia.org/wiki/affinity_maturation)。根据segen医学词典(https://medical-dictionary.thefreedictionary.com/affinity+maturation”>affinity maturation</a>)，亲和力成熟是指免疫后抗体对抗原的平均亲和力增加。亲和力成熟是由于特异性和更均质的igg抗体增加所致，是在igm分子的低特异性且更异质的早期应答之后。
301、此外，高抗-载体应答也带来免疫排斥和相关安全问题的风险。
302、因此，根据本发明鉴定具有高免疫原性、高靶特异性和高耐受性/安全性且载体反应性(即针对蛋白载体)低或不存在的有效构建体，通过创新解决方案成功地解决了这一挑战。此外，对本发明的新型疫苗关键的是，提供的免疫治疗剂不诱导或诱导非常弱的针对糖骨架的免疫应答。这尤其重要，因为通过免疫诱导的高抗clec抗体水平可因疫苗中和而抑制或降低使用相同clec基疫苗重复免疫的效力，或者也可负面影响使用此种疫苗连续免疫抵抗各种不同靶标。
303、本发明的疫苗平台还满足了将针对一个或多个靶标的各种表位组合在一个制剂中的需求，而不会像传统疫苗那样因非预期的表位扩散而造成效力降低的风险。本发明的平台的模块化设计允许轻松交换b细胞表位和t细胞表位，而无载体诱导的应答的负面影响。
304、本发明基于一种对同源(cognate)受体有高特异性结合的clec。这种结合至关重要，只有强结合剂才能有效作为疫苗载体/骨架。
305、根据本发明，clec偶联能实现具有新特征的有效免疫应答。本发明的偶联排除了抗clec(尤其石耳聚糖)抗体的形成，这种排除在本发明的过程中可以令人印象深刻地得到展示。这种抗clec抗体激发的缺乏对于使用本发明的平台设计的单个疫苗的可重复使用性和可重复加强性非常重要——无论其抗原相同还是不同。
306、与本发明的偶联实施方案相反，仅将clec多糖佐剂与b细胞或t细胞表位肽混合不会在体内产生类似的效果。然而，如果偶联，肽的方向不会显著影响本发明化合物的性能；故clec偶联基本上独立于构建体中的肽取向。在本发明的过程中，可以证明clec偶联，尤其是与石耳聚糖的偶联，导致改善新的以及现有的肽免疫原/抗原：这种改善是由更高、更具靶特异性和更具亲和性的抗体反应实现的(如抗体选择性和功能性所示)。这种效果对于石耳聚糖或类似的β-葡聚糖最为明显，它们主要是线性β-(1,6)-葡聚糖，其中β-(1,6)-偶联单糖部分与非β-(1,6)-偶联单糖部分的比例为至少1:1，优选至少2:1，更优选至少5:1，特别是至少10:1，其表现令人惊讶地在直接比较中甚至比klh或crm好很多，以及甚至比甘露聚糖或地衣聚糖偶联物或包含大麦β-葡聚糖的偶联物更好。
307、本文中，术语“主要为线性的”β-(1,6)-葡聚糖是指β-(1,6)-d-葡聚糖不存在或仅存在少量交联糖单体实体，即其中少于1％、优选少于0.1％、尤其是少于0.01％的单糖部分具有两个以上共价连接的单糖部分(moieties)。
308、如上所述，石耳聚糖是本发明最优选的clec。石耳聚糖通常不含交联糖部分，且主要为β-(1,6)-偶联，因此，用于制备本发明偶联物的常见石耳聚糖制剂有少于1％、优选少于0.1％、尤其是少于0.01％的单糖部分具有两个以上共价连接的单糖部分，且有最多10％的杂质具有β-(1,3)-或β-(1,4)-偶联单糖。
309、在本发明的过程中，石耳聚糖被证实是最有效的clec，这一事实是出乎意料的，因为各种参考文献表明，石耳聚糖在dectin-1结合方面应该效果较差(例如adams等，jpharmacol exp ther.2008年4月；325(1)：115-23)；文献中，线性1,3和支链(1,3主链和1,6侧链)已被报道是最有效的dectin-1结合剂。例如，adams等2008报道鼠重组dectin-1仅识别和与含有β-(1,3)连接的葡萄糖骨架的聚合物相互作用。dectin-1不与仅含有β-(1,6)-葡萄糖骨架的葡聚糖(石耳聚糖)相互作用，也不与非葡聚糖的碳水化合物聚合物(如甘露聚糖)相互作用。
310、因此，根据本发明的优选实施方案，本偶联物的β-葡聚糖是dectin-1结合性β-葡聚糖。任何化合物(尤其是葡聚糖)与dectin-1结合的能力都可通过本文公开的(尤其实施例章节中的)方法轻松确定。如有疑问，“dectin-1结合性β-葡聚糖”是指，与可溶性鼠fc-dectin-1a受体结合的ic50值被竞争性elisa测定(如实施例中公开的)为低于10mg/ml的β-葡聚糖。
311、本发明的dectin-1结合性β-葡聚糖(例如线性β-(1,6)-葡聚糖)与其他葡聚糖(例如dc-signβ-葡聚糖(例如β-(1,2)-葡聚糖))相比具有优势，因为有了这种dectin-1结合性葡聚糖可以触及更广泛的dc(未成熟、成熟、髓样、浆细胞样；还有apc)，这显著增加了在体内引发有效免疫应答的可能性，是与限制适用性的非d ectin-1结合性葡聚糖(未成熟dc、髓样dc)相比。
312、wo 2022/060487 a1和wo 2022/060488 a1公开了将肽免疫原与免疫刺激性聚合物分子(例如β-(1,2)葡聚糖)连接的偶联物。β-(1,2)葡聚糖(包括环状变体)以前被认为是潜在的佐剂(martirosyan a等，doi:10.1371/journal.ppat.1002983)。它们是一类主要与特异性prr即dc-sign结合的葡聚糖(zhang h等，doi:10.1093/glycob/cww041)，特异性结合n连接的高甘露糖寡糖和分支岩藻糖结构。重要的是，β-1,2葡聚糖不结合dectin(zhangh等，doi:10.1093/glycob/cww041)，从而限制了它们对dc-sign阳性细胞的活性。
313、dc-sign(cd209)是第一个被识别的sign分子，仅在有限的dc子集(包括未成熟的(cd83阴性)dc以及胎盘和肺中的特化巨噬细胞)上高度表达(soilleux ej等，doi：10.1189/jlb.71.3.445)。在外周，例如皮肤中或粘膜部位，表达以及因此作为本发明受体具有生物活性的潜力仅在未成熟dc子集中可检测到。成熟的浆细胞样dc和其他apc(如上皮dc样朗格汉斯细胞)不表达dc-sign(engering a等，doi：10.4049/jimmunol.168.5.2118)。
314、与此相反，本发明提供的β-葡聚糖基免疫原的靶受体是dectin-1。dectin-1在多种不同类型的dc上表达，不仅包括未成熟dc、髓样dc，还包括在mrna和蛋白质水平均表达dectin-1的浆细胞样dc以及皮肤中的dc样朗格汉斯细胞(patente等，doi：10.3389/fimmu.2018.03176；joo等，doi：10.4049/jimmunol.1402276)。
315、因此，dc-sign靶向聚合物(如β-(1,2)葡聚糖)的生物活性仅限于特定的dc靶细胞群，而本发明中应用的dectin-1靶向聚合物可以在各种不同的其他dc类型中发挥作用。因此，与其他偶联物相比，这些新型偶联物可以发挥明显不同且更优越的免疫应答。因此，现有技术公开的内容并未提示本发明公开的所要求保护的主题。
316、根据特别优选的实施方案，本发明的偶联物包含dectin-1强结合性β-葡聚糖，优选与可溶性鼠fc-dectin-1a受体结合的β-葡聚糖，所述结合的ic50值低于10mg/ml，更优选ic50值低于1mg/ml，甚至更优选ic50值低于500μg/ml，尤其ic50值低于200μg/ml，按竞争性elisa测定，例如见实施例。具体优选的，按竞争性elisa测定，偶联物与可溶性鼠fc-dectin-1a受体结合的ic50值低于1mg/ml，更优选ic50值低于500μg/ml，甚至更优选ic50值低于200μg/ml，尤其是ic50值低于100μg/ml；和/或
317、-β-葡聚糖，其与可溶性人fc-dectin-1a受体结合的ic50值低于10mg/ml，更优选ic50值低于1mg/ml，甚至更优选ic50值低于500μg/ml，尤其是ic50值低于200μg/ml，按竞争性elisa测定；和/或
318、-所述偶联物与可溶性人fc-dectin-1a受体结合的ic50值低于1mg/ml，更优选ic50值低于500μg/ml，甚至更优选ic50值低于200μg/ml，尤其是ic50值低于100μg/ml，按竞争性elisa测定，例如见实施例。
319、此外，本发明的偶联物还显示出与靶多肽反应的抗体相比与载体分子反应的抗体的比例比非clec疫苗(尤其不含石耳聚糖的疫苗)高得多。这显著增加了抗体免疫应答对靶而非载体的特定关注，导致应答的效力和特异性增加。
320、本发明的clec偶联物，尤其是与石耳聚糖的偶联物，也导致对靶蛋白的亲和力成熟(am)增加(am强烈增加，而klh/crm偶联物在重复免疫后仅表现出有限的am)。
321、在疫苗领域，已公开了仅具有b细胞表位或仅具有t细胞表位的合适疫苗。在特定情况下，仅具有t细胞表位或仅具有b细胞表位的疫苗是合适且优选的。然而，市场上的大多数疫苗都含有两种表位，即t细胞表位和b细胞表位。
322、例如，仅含有b细胞表位的疫苗在大多数情况下效果不佳，即使它们确实会导致可检测的抗体免疫应答。然而，在大多数情况下，这种免疫应答通常与含有b细胞和t细胞表位的疫苗相比效果要差得多。这也与本发明实施例章节给出的可检测到较低水平应答的例子一致。
323、另一方面，仅含有t细胞表位的疫苗(例如，在疫苗中，特异性t细胞应答是应答的活性组成)对于某些应用特别有意义，尤其是对于癌症，其中癌症特异性细胞毒性t淋巴细胞和t辅助细胞表位或仅ctl表位与本发明的疫苗平台组合。在这种情况下，具有本发明的clec多糖佐剂的t细胞表位被提供为仅有t细胞表位。这在例如癌症中的体细胞突变影响蛋白编码基因(其可产生潜在的治疗性新表位)的情况下是特别优选的。这些新表位可以指导过继细胞疗法和肽基(及rna基)新表位疫苗利用患者自体细胞毒性t细胞选择性靶向肿瘤细胞。这可以根据本发明用于普遍性抗原和个体化新抗原特异性疗法(例如使用ny-eso-1，mage-a1、mage-a3、mage-c1、mage-c2、mage-c3、survivin、gp100、酪氨酸酶、ct7、wt1、psa、psca、psma、steap1、pap、muc1、5t4、kras、her2等。对于特定的自身免疫病，使用仅含t细胞表位的疫苗可能也是优选的。相应的仅含t细胞表位的偶联物的治疗效果与效应t细胞的减少和调节性t细胞(t reg细胞)群的发展有关，其导致相应的自身免疫病(例如：多发性硬化症或类似疾病)的抑制。
324、由于大多数常用疫苗组合含有b细胞和t细胞表位两者，因此本发明的clec偶联物也优选包含两者，单独的b细胞和t细胞表位(最低限度：至少一个b细胞表位和至少一个t细胞表位)，用以产生持续的b细胞免疫应答。然而，如果需要，较弱的效果可能证明与t细胞无关的免疫力。
325、因此，本发明的偶联物不受可能的疫苗抗原的限制。然而，优选的是，疫苗抗原(即b细胞和/或t细胞表位多肽)的长度为6-50个氨基酸残基，优选为7-40个氨基酸残基，尤其是8-30个氨基酸残基。
326、使用本发明的疫苗，b细胞受体的交联也是可能的。根据一个具体实施方案，本发明的偶联物用于t细胞非依赖性免疫。多糖疫苗的t细胞非依赖性应答是众所周知的。这些疫苗/多糖通过直接刺激b细胞产生免疫应答，而无需t细胞的协助。t细胞非依赖性抗体应答是短暂的。肺炎球菌荚膜多糖的抗体浓度通常在3-8年内下降到基线，具体取决于血清型。通常，不能使用额外的剂量来增强疫苗应答，因为多糖疫苗不构成免疫记忆。在两岁以下的儿童中，多糖疫苗的免疫原性较差。这里直接刺激的原因可能是b细胞表达一种称为cr3(补体受体3型)的分子。巨噬细胞-1抗原或cr3是一种人类细胞表面受体，可见于b-和t-淋巴细胞、多形核白细胞(主要是中性粒细胞)、nk细胞和单核吞噬细胞(如巨噬细胞)。cr3当结合外来细胞和β-葡聚糖时，也识别ic3b，这意味着，疫苗被b细胞通过pus-cr3相互作用直接摄入可导致细胞刺激和产生低水平的ti免疫应答。
327、本发明的佐剂、偶联物和疫苗可以固定补体并可被调理。本发明被调理的偶联物可具有增强的b细胞激活能力，这可导致更高的抗体滴度和抗体亲和力。这种效果对于c3d偶联物是已知的(green等,j.virol.77(2003),2046-2055)，并且意外地也可用于本发明的过程中。
328、本发明的另一意想不到的优势是，本发明的clec结构允许对疫苗进行模块化设计。例如，表位可以随意组合，并且平台不依赖常规载体分子。尽管本发明的主要重点是仅有肽的疫苗，但它也适用于蛋白和肽独立地偶联至、以及肽-蛋白偶联物偶联至本发明的clec骨架(石耳聚糖)。如涉及石耳聚糖的实施例章节所示，本发明比传统疫苗获得了显著优越的免疫应答。
329、如上所述，本发明的偶联物，如果以药物制剂的形式提供(例如，作为打算给(人类)受试者施用的疫苗，以引发对与clec骨架偶联的特定多肽表位的免疫应答，免疫应答应针对该表位进行)，则可以在无需于该制剂中使用(通过共同施用)(另外的)佐剂的情况下施用。根据优选的实施方案，包含本发明偶联物的药物制剂不含佐剂。
330、本发明特别优选的一类clec多糖佐剂是β-葡聚糖，尤其是石耳聚糖。另一种优选的clec多糖佐剂是甘露聚糖。与本发明相反，石耳聚糖在现有技术中仅用于抗真菌疫苗(其中石耳聚糖用作抗原，而不是像本发明中那样用作载体)。石耳聚糖也展示出不同的骨架，它仅由β-(1,6)连接的糖部分组成。
331、石耳聚糖是一种中等大小的线性β-(1,6)葡聚糖。石耳聚糖以及合成形式的线性β-(1,6)葡聚糖不同于所有其他用作β-葡聚糖的葡聚糖，它们通常由支链葡聚糖链组成(优选β-(1,3)主链带β-(1,6)侧链，如酵母提取物、gp、laminarin、裂褶多糖(schizophyllan)、硬葡聚糖(scleroglucan))或仅依赖β-(1,3)葡聚糖的线性葡聚糖如合成β-葡聚糖、卡德兰胶、酿酒酵母β-葡聚糖(150kda)或线性β-(1,3:1,4)葡聚糖如大麦-和燕麦-的β-葡聚糖以及地衣聚糖。
332、如本发明首次所示，葡聚糖偶联物与dectin-1受体的体外结合是后续体内效力的代言：低结合性分子只能发挥低水平免疫应答，中等结合剂较好，而高效结合剂诱导高效应答(燕麦/大麦bg<地衣聚糖<石耳聚糖)。
333、根据本发明，clec与单个多肽偶联(例如通过标准技术)以产生具有低水平多分散性(流体动力学半径(hdr)范围：5-15nm)的小纳米颗粒，其不交联且不会聚集形成类似于常规clec疫苗的较大颗粒，例如文献中公开的葡聚糖粒子(2-4μm)或β-葡聚糖粒子，通常以大小范围>100nm为特征(典型范围(直径；150-500nm，例如wang等(2019)提供的粒子直径为160nm(dls评估)、大小约150nm(tem评估)；jin等(acta biomater.2018年9月15日；78：211-223)提供的β-葡聚糖粒子(胺化β-葡聚糖-卵清蛋白的纳米颗粒)大小为180-215nm(分别经dls和sem评估)。
334、根据定义，dls测量的流体动力学半径是假设的硬球体的半径，其扩散速度与被检查的粒子相同。半径是在假设分子/粒子呈球形和给定缓冲液粘度的情况下从扩散系数计算得出的。hdr也称斯托克斯(stokes)半径，是用stokes-einstein方程(见https://en.wikipedia.org/wiki/stokes_radius)从扩散系数算得的。
335、本发明的纳米粒子的优选尺寸范围可以是现有技术通常提供的那些，即1-5000nm，优选1-200nm，尤其是2-160nm，是由动态光散射(dls)确定的流体动力学半径(hdr)。根据本发明的优选实施方案，粒子尺寸较小，例如1-50nm，优选1-25nm，尤其是2-15nm，是由dls确定的hdr。因此，这些优选的粒子较小，包括仅有肽的偶联物(约5nm平均hdr)和crm-石耳聚糖偶联物(约10-15nm平均hdr)。因此，本发明的优选粒子小于100nm，这区别于wang等。
336、相应地，本发明还涉及一种疫苗产品，其被设计用于对个体接种以对抗特异性抗原，该产品包含一种化合物，该化合物包含β-葡聚糖或甘露聚糖作为c型凝集素(clec)多糖佐剂与所述特异性抗原共价偶联。
337、优选地，本发明的疫苗产品包含本文所述或按本发明的方法可获得或已获得的偶联物。
338、根据优选的实施方案，本发明的疫苗产品包含抗原，所述抗原含有至少一个b细胞表位和至少一个t细胞表位，优选所述抗原是包含一个或多个b细胞表位和t细胞表位的多肽。
339、根据优选实施方案，本发明疫苗产品中共价偶联的抗原和clec多糖佐剂以1-至5000nm、优选1-200nm、尤其2-160nm大小的颗粒形式存在，是由动态光散射(dls)测定的流体动力学半径(hdr)。如本文所用，所有颗粒大小均为中值颗粒大小，其中的中值将颗粒中尺寸较大的一半与尺寸较小的一半分开。从该确定的颗粒尺寸来看，一半颗粒比它小，而另一半颗粒比它大。
340、根据优选的实施方案，本发明的疫苗产品中共价偶联的抗原和clec多糖佐剂以1-50nm，优选1-25nm，尤其2-15nm(是由dls测定的hdr)大小的颗粒形式存在。
341、优选地，本发明疫苗产品中共价偶联的抗原与clec多糖佐剂以小于100nm，50nm，优选小于70nm，尤其小于50nm(dls测的hdr)的颗粒存在。
342、本发明的疫苗产品具有较高的储存稳定性。在以液体或冷冻材料形式储存时(储存温度：-80℃、-20℃、2-8℃或在室温储存较长时间，至少3个月)，几乎不发生聚集，证据是颗粒大小在储存期间并未显著(即超过10％)增加。
343、采用本发明的中分子量组分石耳聚糖制备的这种小颗粒具有极高的效力，这是令人惊讶的：例如，根据adams等(j pharmacol exp ther.2008年4月；325(1)：115-23)，最佳的dectin-1底物是线性β(1,3)葡聚糖磷酸(约150kda)和支链葡聚糖(含有β(1,3)主链和β(1,6)侧链)，如硬葡聚糖或来自白色念珠菌的葡聚糖或laminarin。此外，adams等,palma等(j biol chem.281(9)(2006)5771-5779)和willment等(j biol chem.276(47)(2001),43818-23)的数据暗示，dectin-1与石耳聚糖无或仅有微弱的相互作用，与非葡聚糖的碳水化合物聚合物(如甘露聚糖)也无相互作用。事实上，各种参考文献都报道了石耳聚糖在dectin-1结合方面效果较差。然而，一般来说，线性1,3和支链(1,3主链和1,6侧链)是最有效的dectin-1结合剂；adams等(2008)表明小鼠重组dectin-1仅识别并与含有β(1,3)连接的葡萄糖骨架的聚合物相互作用。dectin-1不与仅含β(1,6)-葡萄糖骨架(如石耳聚糖)的葡聚糖相互作用，也不与非葡聚糖的碳水化合物聚合物(如甘露聚糖)相互作用。
344、与这些发现相反，本发明的过程中发现，石耳聚糖基偶联物在体外能与dectin-1牢固结合并引发细胞应答。
345、根据本发明的优选实施方案，使用了β-(1,6)-葡聚糖。现有技术通常报道大颗粒比小(“可溶性”)单体制剂更有效激活prr，因此含有大葡聚糖的颗粒更优越(因此是优选的)，而小的可溶性葡聚糖可用于阻断dc的激活，从而干扰预期效果。众所周知，颗粒化β-葡聚糖(例如广泛使用的酵母细胞壁级分zymosan)结合并激活dectin-1，由此诱导细胞应答。相比之下，可溶性β-葡聚糖与dectin-1的相互作用仍被争议。虽然普遍的共识是，可溶性β-葡聚糖，如小分子支链葡聚糖laminarin(β-(1,3)和β-(1,6)侧链)结合dectin-1但无法启动信号传导并诱导dc中的细胞性应答(willment等，j biol chem.276(47)(2001)，43818-23，goodridge等，nature.2011,472(7344):471–475.)。
346、根据本发明，可以证明使用高分子量葡聚糖(10倍于石耳聚糖的大小；例如：燕麦/大麦229kda/地衣聚糖245kda)的偶联物的表现不如石耳聚糖颗粒(20kda)有效。korotchenko等表明，ova/lam偶联物的直径约10nm，结合dectin-1并在体外诱导dc活化，但它们是支链葡聚糖，无皮肤特异性，体内效力不比应用到皮肤中的ova或皮下应用的ova/alum优越。wang等提供>100nm的β-葡聚糖粒子(平均尺寸：160nm)。jin等(2018)展示了180-215nm大小的胺化β-葡聚糖-卵清蛋白纳米颗粒。
347、本发明发现，石耳聚糖基颗粒是强效的dectin-1结合剂，在体外激活dc(表面标志物表达有变)并引发非常强的免疫应答，优于a)其他途径和b)可比于klh/crm偶联疫苗(通常也是大很多的颗粒)和c)更大的葡聚糖和甘露聚糖。这对于pep+padre+石耳聚糖(尺寸为5nm)和pep+crm+石耳聚糖(尺寸为11nm)是事实。
348、为了获得最佳免疫应答，clec(尤其是石耳聚糖)的活化程度，以及此活化程度导致的肽/糖比至关重要。相应clec的活化可通过温和的高碘酸盐氧化实现。因此，氧化程度取决于以指定摩尔比添加高碘酸盐溶液：即高碘酸盐：糖亚基；100％＝每摩尔糖单体1摩尔高碘酸盐。
349、根据优选实施方案，本发明的偶联物包含活化的clec，其中高碘酸盐与β-葡聚糖或甘露聚糖(单体)部分的比率为1/5(即20％活化)～2.6/1(即260％活化)，优选60％～140％，尤其是70％～100％。
350、低/中等氧化程度与高氧化程度之间的氧化程度最佳范围(将与最终偶联物中的表位多肽的数量成正比)可定义为与schiff品红试剂的反应性类似于等量的给定碳水化合物(例如，石耳聚糖)被高碘酸盐分别以摩尔比(糖单体：高碘酸盐)0.2-0.6(低/中),0.6-1.4(最佳范围)和1.4-2.6(高)氧化的反应性。
351、葡聚糖与肽的优选比例为10比1(w/w)～1比1(w/w)，优选8比1(w/w)～2比1(w/w)，尤其是4比1(w/w)；即糖单体与肽的摩尔比为24比1，但如果偶联物包含载体蛋白，则β-葡聚糖或甘露聚糖与b细胞表位-载体多肽的优选比例为50:1(w/w)～0.1:1(w/w)，尤其是10:1～0.1:1；该比例低于其他报道的有效疫苗(例如liang等,bromuro等)。
352、可用于糖偶联的氧化程度和活性醛的量用现有方法确定，如：1)重量测量，可以确定样品的总质量；2)蒽酮法(根据laurentin等2003)-用于测定样品中完整无损的未氧化的糖的浓度；在这种情况下，葡聚糖用浓h2so4脱水形成糠醛，糠醛与蒽酮(h2so4中0.2％)缩合形成绿色复合物，其可在620nm比色测量)或3)schiff分析：使用schiff品红-亚硫酸盐试剂评估偶联所用碳水化合物的氧化状态。简言之，品红染料被二氧化硫脱色。与脂肪醛(在葡聚糖上)反应恢复品红的紫色，然后可在570-600nm处测量。产生的颜色反应与碳水化合物的氧化程度(醛基数量)成正比。其他合适的分析方法也是可能的。肽比率可以用合适的方法评估，包括uv分析(205nm/280nm)和氨基酸分析(aa水解、衍生化和rp-hplc分析)。
353、本发明的偶联物还可用来诱导靶特异性免疫应答，同时不诱导或仅诱导非常有限的clec-或载体蛋白-特异性抗体应答。如下面实施例章节所示，本发明还能改善和集中靶特异性免疫应答，因为它触发的免疫应答远离对载体蛋白或clec的反应(例如在常规肽-载体偶联物或非偶联的可比设定中，尤其还应用了非氧化的clec，例如石耳聚糖)。
354、除非另有说明，本文所用的“肽”是指较短的多肽链(2-50个氨基酸残基)，而“蛋白质”是指较长的多肽链(超过50个氨基酸残基)。两者都称为“多肽”。根据本发明，与clec偶联的b细胞和/或t细胞表位多肽除了包含正常基因表达和蛋白翻译中天然使用的氨基酸残基的多肽外，还包括所有其他形式的此类基于多肽的b细胞和/或t细胞表位，尤其是其天然或人工修饰形式，例如糖多肽和所有其他翻译后修饰形式(例如实施例中公开的aβ的焦谷氨酸形式)。此外，本发明的clec特别适合于呈递构象表位，例如作为较大天然多肽、模拟表位、环状多肽或表面结合型构建体的一部分的构象表位。
355、根据优选实施方案，本发明的偶联物包含clec多糖骨架和b细胞表位。“b细胞表位”是抗原上被免疫球蛋白或抗体结合的部分。b细胞表位可分为两组：构象表位或线性表位。表位作图主要有两种方法：结构研究或功能研究。对表位进行结构作图的方法包括x射线晶体学、核磁共振、和电子显微镜。对表位进行功能作图的方法通常使用结合测定，例如western印迹、斑点印迹和/或elisa来确定抗体结合。竞争法确定两种单克隆抗体(mabs)是否可以同时与一种抗原结合或在同一位点相互竞争结合。另一种技术涉及高通量诱变，这种表位作图策略旨在改善对结构复杂蛋白的构象表位的快速作图。诱变利用单个残基处的随机/定点突变来给表位作图。b细胞表位作图可用于开发抗体疗法、肽基疫苗、和免疫诊断工具(sanchez-trincado等，j.immunol.res.2017-2680160)。对于多种抗原，b细胞表位是已知的，可用于目前的clec平台。
356、根据特别优选的实施方案，本发明的偶联物包含clec多糖骨架和一个或多个t细胞表位，优选包含混杂型t细胞表位和/或mhcii表位，已知其可与给定物种以及其他物种的数个/所有mhc等位基因一起起作用。
357、根据另一方面，本发明还涉及利用本clec技术改进已知的t细胞表位。因此，本发明还包括β-葡聚糖或甘露聚糖用作t细胞表位多肽的c型凝集素(clec)多糖佐剂，其中β-葡聚糖或甘露聚糖与t细胞表位多肽共价偶联，形成β-葡聚糖或甘露聚糖与t细胞表位多肽的偶联物。
358、结合一个以上hla等位基因的单个t细胞表位称为“混杂型t细胞表位”。优选的混杂型t细胞表位结合5个或更多个、优选10个或更多个、尤其是15个或更多个hla等位基因。混杂型t细胞表位适用于不同物种，最重要的是适用于给定物种以及其他物种的数种mhc/hla单倍型(指已知可与数种/所有mhc等位基因一起发挥作用的mhci和mhcii表位)。例如，实施例章节提到的mhcii表位padre(＝非天然泛dr表位(padre))在数种人类mhc等位基因和小鼠(c57/bl6，但在balb/c中效力较差)中起作用。例如，实施例章节提到的mhcii表位padre(＝非天然泛dr表位(padre))在数种人类mhc等位基因和小鼠(c57/bl6，但在balb/c中效力较差)中起作用。根据优选实施方案，本发明的偶联物包含t细胞表位，优选含氨基酸序列akfvaawtlkaaa(“padre(多肽)”)或padre(多肽)变体的t细胞表位。
359、优选的padre多肽或padre多肽变体包括接头(对于本文使用的其他多肽表位也是优选的)，例如半胱氨酸残基或包含半胱氨酸残基的接头(“-c”或“c-”；特别用于马来酰亚胺偶联),nrra,nrra-c或nrra-nh-nh2接头。优选的padre多肽变体包括现有技术中公开的变体(例如alexander等,immunity 1(1994)，751-761；us 9,249,187 b2，或)，优选没有c末端a残基的缩短变体(akfvaawtlkaa)，第一个残基丙氨酸被脂肪族氨基酸残基(例如甘氨酸，缬氨酸，异亮氨酸和亮氨酸)取代的变体，第三个残基苯丙氨酸被l-环己基丙氨酸取代的变体，第十三个(最后)氨基酸残基丙氨酸被脂肪族氨基酸残基(例如甘氨酸，缬氨酸，异亮氨酸和亮氨酸)取代的变体，包含氨基己酸的变体，优选与padre变体的c末端偶联，或具有氨基酸序列ax1fvaax2tlx3ax4a的变体，其中x1选自w、f、y、h、d、e、n、q、i和k；x2选自f、n、y和w，x3选自h和k，x4选自a、d和e(前提是寡肽序列不是akfvaawtlkaaa；us 9,249,187 b2)；尤其，t细胞表位选自akfvaawtlkaaanrra-(nh-nh2),akfvaawtlkaaan-c,akfvaawtlkaaa-c,akfvaawtlkaaanrra-c,akxvaawtlkaaazc,akxvaawtlkaaazcnrra(seqid7,8,87,88,89,90,91,92),akxvaawtlkaaa,akxvaawtlkaaanrra,aa(x)aaaktaaaaa,aa(x)aaatlkaaa,aa(x)vaaatlkaaa,aa(x)iaaatlkaaa,ak(x)vaawtlkaaa,和akfvaawtlkaaa(alexander等1994的序列760.5、760.57、906.09,906.11,965.10,1024.03)，其中x为l-环己基丙氨酸，z为氨基己酸，a为选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的脂肪族氨基酸残基。
360、t细胞表位呈递在抗原呈递细胞的表面，在那里它们与主要组织相容性复合体(mhc)分子结合。在人类中，特化的抗原呈递细胞专门呈递mhc ii类肽，而大多数有核体细胞呈递mhc i类肽。mhc i类分子呈递的t细胞表位通常是8-11个氨基酸的肽，而mhc ii类分子呈递更长的肽，长度为13-17个氨基酸；非经典的mhc分子也呈递非肽表位，例如糖脂。mhci类和ii类表位通过仅仅计算手段就可以可靠地预测，但并非所有t细胞表位计算机预测算法的准确性都相同。预测肽-mhc结合的主要方法有两种：数据驱动和基于结构。基于结构的方法模拟肽-mhc结构，需要强大的计算能力。数据驱动方法比基于结构的方法具有更高的预测性能。数据驱动方法根据结合mhc分子的肽序列预测肽-mhc结合(sanchez-trincado等,2017)。通过识别t细胞表位，科学家可以追踪、表型和刺激t细胞。对于许多抗原，t细胞表位是已知的，可用于本clec平台。
361、有趣的是，最近的突破性研究表明，帕金森病(pd)患者的α-突触核蛋白特异性t细胞增多，可能与hla的风险单倍型有关，还提示t细胞在帕金森病中参与了自身免疫[sulzer等，nature 2017；546：656–661和lindestamn arlehamn等，nat commun.1875；2020：11]。α-突触核蛋白反应性t细胞的因果作用最近也被动物模型研究证实[williams等，brain.2021；144：2047-2059]。一项案例研究显示，在运动发作前数年，α-突触核蛋白反应性t细胞的发生率增加，其频率在一组较大的pd患者横断面队列中是在运动发作前后以及之后不久最高(lindestam arlehamn等)。运动发作后，t细胞对α-突触核蛋白的应答随着疾病持续时间的增加而下降。因此，抗asyn t细胞应答在运动pd诊断之前或诊断后不久达到最高水平，此后逐渐减弱(即诊断后不到10年可检测到最大活性；hoehn和yahr(h+y)阶段1和2为优选)(lindestamn arlehamn等，2020)。
362、因此，人α-突触核蛋白序列中含有常见的t细胞表位。benner等(plos one 3(1):e1376.60)、sulzer等(2017)和lindestam arlehamn等(2020)提供了示例。
363、benner等(benner等,(2008)plos one 3(1):e1376.)使用60aa长、含asyn c端部分的硝化(在y残基处)多肽，其乳化在等体积cfa中，含有1mg/ml结核分枝杆菌作为pd模型中的免疫原，该文还公开了α-突触核蛋白t细胞表位aa71-86(vtgvtavaqktvegagniaaatgfvk)。
364、sulzer等(nature 2017；546：656-661)在人类pd患者的α-突触核蛋白的n端和c端区域发现了两个t细胞抗原区。第一个区位于n端附近，包含mhcii表位aa31-45(gktkegvlyvgsktk)和aa32-46(ktkegvlyvgsktke)，还包含9肽aa37-45(vlyvgsktk)作为潜在的mhci类表位。sulzer等披露的第二个抗原区位于c端附近(aa116–140)，需要对氨基酸残基s129进行磷酸化。三个磷酸化的aas129表位aa116-130(mpvdpdneayempse)、aa121-135(dneayempseegyqd)和aa126-140(empseegyqdyepea)在pd患者中产生的应答明显高于健康对照。作者还证明，对pd相关α突触核蛋白的天然免疫应答同时具有mhc i类和ii类限制成分。
365、此外，lindestam arlehamn等(nat commun.1875；2020:11)也公开了α突触核蛋白肽aa61-75(eqvtnvggavvtgvt)作为pd患者的t细胞表位(mhcii)。
366、相应地，本发明优选的t细胞表位包括α突触核蛋白多肽gktkegvlyvgsktk
367、(aa31-45),ktkegvlyvgsktke(aa32-46),eqvtnvggavvtgvt(aa61-75),vtgvtavaqktvegagniaaatgfvk(aa71-86),dpdneayempse(aa116-130),dneayempseegyqd(aa121-135),和empseegyqdyepea(aa126-140)。
368、调节性t细胞(“treg细胞”或“tregs”)是t细胞的一个亚群，其调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性并预防自身免疫病。treg细胞具有免疫抑制作用，通常抑制或下调效应t细胞的诱导和增殖。正常胸腺产生的treg被称为“天然”treg。天然treg的选择发生在髓质中的放射抗性造血衍生的mhc ii类表达细胞或胸腺中的哈氏小体(hassal’scorpuscles)上。treg选择的过程取决于与自身肽mhc复合物相互作用的亲和力。选择成为treg是一个“金发姑娘”过程-即不太高，也不太低，但恰到好处，接收非常强信号的t细胞将经历凋亡；接收弱信号的细胞将存活并被选为效应细胞。如果t细胞接收到中间信号，则它将成为调节细胞。由于t细胞激活过程的随机性，所有具有给定tcr的t细胞群最终都会成为teff和treg的混合物——相对比例由t细胞对自身肽-mhc的亲和力决定。由胸腺外(即外周)或细胞培养中免疫幼稚化t细胞分化形成的treg称为“适应性”或“诱导性”(即itreg)。
369、天然treg的特征是表达cd4 t细胞共-受体和cd25，cd25是il-2受体的组成部分。因此，treg是cd4+cd25+。核转录因子forkhead box p3(foxp3)的表达是决定天然treg发育和功能的决定性特性。treg抑制cd4+t细胞和cd8+t细胞的激活、增殖和细胞因子生成，并被认为抑制b细胞和树突细胞，从而抑制自身免疫反应。
370、沿着这些思路，多项研究表明pd患者的treg数量和功能降低。例如：huttersaunders等(j neuroimmune pharmacol(2012)7:927-938)和chen等(molecular medicinereports12:6105-6111,2015)表明pd患者的调节性t细胞(treg)抑制效应t细胞功能的能力受损，并且th1和th17细胞的比例增加，而th2和treg细胞的比例减少。thome等(npjparkinson's disease(2021)7:41)表明，pd treg功能下降与促炎性t细胞活化增加相关，这可直接导致其他免疫细胞群随后增加促炎信号。treg对t细胞增殖的抑制与外周促炎免疫细胞表型显著相关。使用h&y疾病量表显示，pd treg对t效应细胞(如cd4+)增殖的抑制能力随着pd疾病负担的增加而降低，在h+y 1和2期活性最高。重要的是，lindestam arlehamn等(2020)表明，抗asyn t细胞应答在运动性pd诊断之前或诊断后不久最高，此后逐渐减弱(即在诊断后不到10年内可检测到最大活性；并且hoehn和yahr(h+y)1和2期是优选)(lindestamn arlehamn等，2020)。
371、因此，本发明的疫苗与以下组合
372、1)疫苗，含有α突触核蛋白特异性treg表位(例如cd4表位，如brenner等,sulzer等和lindestam arlehamn等公开的(aa31-45(gktkegvlyvgsktk),aa32-46(ktkegvlyvgsktke),aa61-75(eqvtnvggavvtgvt),aa71-86(vtgvtavaqktvegagniaaatgfvk),aa116-130(mpvdpdneayempse),aa121-135(dneayempseegyqd),和aa126-140(empseegyqdyepea))；和/或
373、2)treg诱导剂，如雷帕霉素、低剂量il-2、tnf受体2(tnfr2)激动剂、抗cd20抗体(如利妥昔单抗)、泼尼松龙、肌苷普拉诺贝克斯(inosine pranobex)、醋酸格拉替雷(glatiramer acetate)、丁酸钠
374、在疾病的早期阶段(即诊断后不到10年；且hoehn和yahr第1和第2期)是优选的，以增加逐渐减弱/降低的treg数量和活性，从而降低asyn特异性t效应细胞的自身免疫反应性并抑制pd患者的自身免疫应答。
375、此外还发现，treg在多种疾病中减少和/或功能失调，尤其是慢性退行性疾病或自身免疫病如(活跃型)系统性红斑狼疮(sle,asle)、1型糖尿病(t1d)、自身免疫性糖尿病(aid)、多发性硬化症(ms)、肌萎缩侧索硬化症(als)和阿尔茨海默病(ad)以及其他退行性疾病(als：beers等，jci insight 2，e89530(2017)；ad：faridar等，brain commun.2，fcaa112(2020)；als：beers等，jamaneurol.75,656-658(2018)；ms：haas等，eur.j.immunol.35,3343-3352(2005)；t1d：lindley等，diabetes 54,92-99(2005)：aid：putnamet al.,j.autoimmun.24,55-62(2005)；自身免疫病：ryba-stanislawowska等，expert rev.clin.immunol.15,777-789(2019)；asle：valencia等，j.immunol.178,2579-2588(2007)；ms：viglietta等，j.exp.med.199,971-979(2004)；sle：zhang等，clin.exp.immunol.153,182-187(2008)；ad+ms：ciccocioppo等，sci.rep.9，8788(2019))。
376、因此，还优选在treg群体减少或功能失调的疾病中提供适合作为treg表位或treg诱导剂的t细胞表位，作为与本发明疫苗的组合，以使减少/降低的treg数量和活性增加，从而降低疾病特异性t效应细胞的自身免疫应答、并抑制患者的自身免疫应答。而合适的treg表位被定义为自身mhc表位(mhcii型)，其特征是在t细胞选择过程中诱导中间信号的能力。
377、根据优选的实施方案，本发明的偶联物包含多肽，所述多肽包含或组成为氨基酸序列seqid7,8,22-29,87-131,gktkegvlyvgsktk,ktkegvlyvgsktke,eqvtnvggavvtgvt,vtgvtavaqktvegagniaaatgfvk,mpvdpdneayempse),dneayempseegyqd,empseegyqdyepea或其组合。
378、因此，优选的t细胞表位是：
379、
380、
381、其中x是l-环己基丙氨酸，z是氨基己酸，a是选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的脂肪族氨基酸。
382、根据另一优选实施方案，本发明的偶联物包含b细胞表位和t细胞表位，优选全特异性/混杂性t细胞表位，其独立地与本发明的clec多糖骨架(尤其是石耳聚糖)偶联。
383、根据另一优选实施方案，本发明的偶联物包含与“经典”载体蛋白(如crm197)偶联的b细胞表位，该构建体还与本发明的clec载体(尤其石耳聚糖)偶联。
384、例如，在第一步中，可以通过gmbs或磺基-gmbs等活化crm来形成crm偶联物；然后活化的crm的马来酰亚氨基与肽(半胱氨酸)的sh基反应。然后用dtt处理crm偶联物以还原二硫键并在半胱氨酸上生成sh基。随后，可以进行一锅反应，将还原的crm-偶联物与bmph(n-β-马来酰亚胺-丙酸酰肼)和活化的石耳聚糖(氧化型)混合以生成clec基疫苗。一锅反应中的机制可能是(就石耳聚糖而言)氧化的石耳聚糖与bmph(具有酰肼残基)反应并形成bmph-腙。然后还原的crm偶联物借由crm-偶联物上的sh基与bmph活化的石耳聚糖的马来酰亚胺反应。
385、根据另一优选实施方案，本发明的偶联物包括“经典”载体蛋白如crm197，其含有多个t细胞表位。本发明的偶联物还包含b细胞表位与多糖部分共价偶联。在该实施方案中，两种多肽(b细胞表位和载体分子)均独立地与本发明的clec载体(尤其是与石耳聚糖)偶联。
386、根据另一优选实施方案，本发明的偶联物还包含“经典”载体蛋白如crm197，其含有多个t细胞表位。本发明的偶联物还包括与“经典”载体蛋白共价偶联的b细胞表位。本发明的肽-载体偶联物也与多糖部分共价偶联。在该实施方案中，两种多肽(b细胞表位和载体分子)结合成一个偶联物与本发明的clec载体(尤其是与石耳聚糖)偶联。载体蛋白则代表了本发明偶联物中的β-葡聚糖或甘露聚糖与b细胞和/或t细胞表位多肽之间的连接。β-葡聚糖或甘露聚糖与b细胞和/或t细胞表位多肽之间的共价偶联再由载体蛋白(作为功能性连接部分)进行。
387、本发明的优选偶联物可包含与crm197偶联的b细胞表位，该构建体还与本发明的clec聚合物偶联，特别是与β-葡聚糖偶联，其中β-葡聚糖为石耳聚糖、地衣聚糖、laminarin、卡德兰胶、β-葡聚糖肽(bgp)、裂褶多糖、硬葡聚糖、全葡聚糖粒子(wgp)、zymosan，或香菇多糖(lentinan)，优选石耳聚糖、laminarin、地衣聚糖、香菇多糖、裂褶多糖或硬葡聚糖，尤其是石耳聚糖。
388、本发明发现，与石耳聚糖偶联的新型b细胞表位-crm197偶联物是强效dectin-1结合剂，可引发非常强的免疫应答，优于传统的crm偶联疫苗。
389、本发明发现，clec与新型b细胞表位-crm197偶联物的偶联，特别是生成b细胞表位-crm197-葡聚糖，更优选b细胞表位-crm197-线性β-(1,6)-葡聚糖或b细胞表位-crm197-石耳聚糖偶联物，对于诱导各种肽-crm197-clec(特别是肽-crm197-β-葡聚糖，更优选肽-crm197-线性β-(1,6)-葡聚糖或肽-crm197-线性石耳聚糖偶联物)的优于传统crm偶联疫苗(带或不带佐剂，通过与β-葡聚糖/石耳聚糖混合而成)的免疫原性是不可或缺的。
390、根据本发明的优选实施方案，本发明的clec偶联物包含作为b细胞表位的寡糖/多糖，其偶联至作为t细胞表位来源的载体蛋白(例如：crm197、klh、白喉类毒素(dt)、破伤风类毒素(tt)、流感嗜血杆菌蛋白d(hipd)、b血清群脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(ompc)、重组无毒形式的铜绿假单胞菌外毒素a(repa)、鞭毛蛋白、大肠杆菌热不稳定肠毒素(lt)、霍乱毒素(ct)、突变毒素(例如ltk63和ltr72))，该构建体进一步与本发明的clec聚合物偶联，尤其是与β-葡聚糖偶联，所述β-葡聚糖是石耳聚糖、地衣聚糖、laminarin、卡德兰胶、β-葡聚糖肽(bgp)、裂褶多糖、硬葡聚糖、全葡聚糖粒子(wgp)、zymosan或香菇多糖，优选石耳聚糖、laminarin、地衣聚糖、香菇多糖、裂褶多糖或硬葡聚糖，尤其是石耳聚糖。如果偶联物包含载体蛋白，则本发明的优选实施方案是，本发明的偶联物包含至少一个另外的、独立偶联的t细胞或b细胞表位。该优选实施方案进一步阐明，本发明不是关于引发抗线性为主的β-(1,6)-葡聚糖的特异性抗体，所述葡聚糖的(1,6)偶联单糖部分与非β-(1,6)偶联单糖部分之比至少为1:1，例如石耳聚糖。因此，本发明不包括含有主要是线性的β-(1,6)-葡聚糖、其(1,6)-偶联单糖部分与非β-(1,6)-偶联单糖部分之比为至少1:1、且仅含有糖类作为抗原并含有载体蛋白的偶联物，因为本发明的偶联物如果含有额外的t细胞或b细胞表位，则在体内显著降低或消除针对所述葡聚糖骨架的强烈从头免疫应答的诱导(例见实施例7和图7，下文)。相反，重复应用未偶联的葡聚糖(或仅与载体蛋白偶联的葡聚糖)通过提高抗葡聚糖多糖的抗体水平而诱导强烈的抗葡聚糖免疫应答。这表明，本发明的偶联物必须具有另外的t细胞或b细胞表位多肽，该多肽与主要为线性的β-(1,6)-葡聚糖和载体蛋白的偶联物共价结合。这也解释了本发明的偶联物不包括通过提供主要为线性的β-(1,6)-葡聚糖(其(1,6)-偶联单糖部分与非β-(1,6)-偶联单糖部分之比至少为1:1)作为抗原(最终与载体蛋白偶联)来预防或治疗由真菌(尤其白色念珠菌)直接或间接引起的疾病。
391、本发明发现，这种与石耳聚糖偶联的寡糖/多糖偶联疫苗是强效的dectin-1结合剂，如果在体内使用，会引起有益/有效的免疫应答。
392、因此，本发明还涉及改进和/或优化载体蛋白，是将载体蛋白(已含有一种或多种t细胞抗原(作为其多肽序列的一部分，任选地为翻译后修饰形式))共价偶联到本发明的clec多糖佐剂，即β-葡聚糖或甘露聚糖，优选地共价偶联到石耳聚糖、地衣聚糖、laminarin、卡德兰胶、β-葡聚糖肽(bgp)、裂褶多糖、硬葡聚糖、全葡聚糖粒子(wgp)、zymosan或香菇多糖。因此，本发明涉及一种用作b细胞和/或t细胞表位多肽的c型凝集素(clec)多糖佐剂的β-葡聚糖或甘露聚糖，其中β-葡聚糖或甘露聚糖与b细胞和/或t细胞表位多肽共价偶联，形成β-葡聚糖或甘露聚糖与b细胞和/或t细胞表位多肽的偶联物，其中载体蛋白与β-葡聚糖或甘露聚糖共价偶联。
393、这种改进/优化导致b细胞对clec和/或对载体蛋白的应答显著减少或消除，和/或t细胞对载体蛋白的t细胞表位的应答增强(或至少保持)。这使得能减少或消除对clec和/或载体的抗体应答(然后载体仅传递t细胞应答)，和特异性增强对与载体和/或clec偶联的真正靶多肽的抗体应答。
394、因此，本发明一个特别优选实施方案是偶联物，其由以下组成或包含
395、(a)β-葡聚糖
396、(b)至少一种b细胞或t细胞表位多肽，以及
397、(c)载体蛋白，
398、其中三个组分(a)、(b)和(c)彼此共价结合。
399、三种组分的该组合可以以任意方向或顺序提供，即以(a)-(b)-(c)、(a)-(c)-(b)或(b)-(a)-(c)的顺序提供，其中(b)和/或(c)可以从n端至c端共价偶联或从c端至n端共价偶联，或者通过多肽内的功能基团(例如赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸或组氨酸残基中的功能基团，特别是赖氨酸残基的ε-氨基)偶联。当然，β-葡聚糖可以与组分(b)和(c)各一个或多个偶联，优选通过本文公开的方法。优选地，这些组分通过接头偶联，特别是通过所有组分(至少是三种)之间的接头偶联。本文公开了优选的接头，例如半胱氨酸残基，或接头包含半胱氨酸或甘氨酸残基，接头得自酰肼介导的偶联、得自经异双功能接头(例如bmph、mpbh、emch或kmuh)的偶联、得自咪唑介导的偶联、得自还原胺化、得自碳二酰亚胺偶联-nh-nh2接头；nrra、nrra-c或nrra-nh-nh2接头、肽接头(例如二聚体、三聚体、四聚体(或更长聚体)肽基团，例如cg或cg)。对于已有的载体蛋白，尤其是crm、crm197和klh，所述至少三种组分的优选顺序为(a)-(c)-(b)，即，β-葡聚糖和至少一种b细胞或一种t细胞表位多肽偶联至载体蛋白。
400、根据另一优选实施方案，本发明的偶联物包含t细胞表位且不含b细胞表位，其中偶联物优选包含不止一个t细胞表位，特别是两个、三个、四个或五个t细胞表位。该构建体特别适用于癌症疫苗。该构建体还特别适用于自身抗原，特别是自身免疫病相关的自身抗原。相应偶联物的治疗效果与效应t细胞的减少和调节性t细胞(treg细胞)群的发展有关，这导致相应疾病(例如自身免疫病或过敏性疾病)的抑制，如多发性硬化症所示。值得注意的是，这些t reg细胞执行强大的旁观者免疫抑制，从而改善由同源和非同源自身抗原引起的疾病。
401、用作本发明多糖骨架的优选clec是石耳聚糖或其他β-(1,6)葡聚糖(也包括此类葡聚糖的合成形式)；其他可用的有：甘露聚糖、β-葡聚糖家族成员，尤其线性β-(1,3)(酿酒酵母β-葡聚糖(例如：150kda)、卡德兰胶)或含支链β-(1,3)和β-(1,6)的葡聚糖，例如：laminarin(4,5-7kda)、硬葡聚糖、裂褶多糖，更优选线性葡聚糖，(例如：β(1,3)：酿酒酵母β-葡聚糖(150kd)、卡德兰胶(75-80kda或更大)、β-(1,3)+β-(1,4)地衣聚糖(22-250kda)β-(1,6)石耳聚糖(20kda)。因此，根据本发明优选的clec是甘露聚糖和β-葡聚糖，包括线性和支链β-葡聚糖，其特征是有β-(1,3)-、β-(1,3)+β-(1,4)-和β(-1,6)主链以及附有带β-(1,6)残基的侧链，更优选线性β-葡聚糖含有β-(1,3)、β-(1,3)+β-(1,4)和β-(1,6)链，更优选线性β-(1,6)β-葡聚糖，尤其是石耳聚糖，它们的由多聚体β-(1,6)-葡聚糖(例如4聚体、5聚体、6聚体、8聚体、10聚体、12聚体、15聚体、17聚体或25聚体)组成的片段或合成变体。
402、优选地，本发明的clec的最小长度为6聚体，因为对于较小的多糖，按本发明进行的氧化反应会有问题(最终其他偶联机制可用于这类较小形式和/或通过添加反应性形式进行末端连接)。具有6个或更多单体单元(即6聚体和更大的聚体)的clec表现出良好的dectin结合。通常，clec越长，dectin结合越好。聚合度(即一个葡聚糖实体内的单个葡萄糖分子的数量，dp)为20-25(即dp20-25)肯定确保了良好的结合和体内效力(例如，laminarin是dp20-30的典型例子)。
403、合成性clec的分子量也可更小，例如低至1-2kda，而葡聚糖及其片段的优选分子量范围可以是1-250kda(例如laminarin、地衣聚糖、酿酒酵母β-葡聚糖、石耳聚糖、卡德兰胶和大麦葡聚糖等)，优选4.5-80kda(例如laminarin、石耳聚糖、卡德兰胶、低分子量地衣聚糖等)，尤其是4.5-30kda(例如laminarin、石耳聚糖、低分子量地衣聚糖等)。甘露聚糖是甘露糖的线性聚合物。植物甘露聚糖具有β-(1,4)键。它们是一种储糖形式。酵母中发现的甘露聚糖细胞壁多糖具有α-(1,6)连接的骨架和α-(1,2)和α-(1,3)连接的分支。它在血清学上与哺乳动物糖蛋白上的结构相似。
404、为了生产本发明的偶联物，必须激活clec，尤其是石耳聚糖(例如通过使用温和的高碘酸盐介导的氧化)，氧化程度对于免疫应答很重要。如上所述，实际氧化范围(特别是对于石耳聚糖)为约20-260％氧化。在许多情况下，最佳氧化范围介于低/中程度氧化(即20-60％氧化)和高程度氧化(即140-260％氧化)之间，即在60-140％氧化的范围内。其他clec的优化可以由本领域技术人员轻松调适，例如对于地衣聚糖，需要超过200％才能获得类似量的醛基。
405、因此，所述范围也可以替代地定义为与schiff品红试剂的反应性，以石耳聚糖为例，可定义如下：氧化程度低/中等在摩尔比(糖单体：高碘酸盐)0.2-0.6，最佳范围0.6-1.4，高程度氧化为1.4-2.6。
406、无论如何，氧化程度的定义应满足每个特定clec的最佳范围。优选地，线性β-葡聚糖，更优选β-(1,6β-葡聚糖，尤其是石耳聚糖、石耳聚糖片段或其由多聚体β(1,6)-葡聚糖(例如4聚体、5聚体、6聚体、8聚体、10聚体、12聚体、15聚体、17聚体或25聚体)组成的合成变体，通过温和的高碘酸氧化活化，导致邻位oh基团的裂解，从而产生活性醛。温和的高碘酸氧化是指使用高碘酸钠(naio4)，一种众所周知的温和试剂，可有效氧化碳水化合物糖中的邻位二醇以产生活性醛基。相邻羟基之间的碳-碳键被裂解。通过改变高碘酸盐的用量，可以将醛以化学计量的方式引入给定多糖的更少或更多数量的糖部分中。
407、用于活化碳水化合物的其它示例性方法在本领域中是众所周知的，包括羟基的氰基化(例如：通过使用有机氰基化试剂，如1-氰基-4-(二甲氨基)-吡啶四氟硼酸盐(cdap)或n-氰基三乙基铵四氟硼酸盐(ctea))，碳水化合物的还原胺化或使用羧酸反应性化学基团如碳二酰亚胺进行活化和偶联。
408、然后，活化的碳水化合物与将要偶联至活化型clec的多肽发生反应，形成clec与b细胞或t细胞表位多肽的偶联物。
409、因此，本发明还涉及一种生产本发明偶联物的方法，其中β-葡聚糖或甘露聚糖通过氧化作用被活化，活化的β-葡聚糖或甘露聚糖与b细胞和/或t细胞表位多肽接触，从而获得β-葡聚糖或甘露聚糖与b细胞和/或t细胞表位多肽的偶联物。
410、优选地，β-葡聚糖或甘露聚糖是通过在邻位羟基上进行高碘酸盐氧化、还原胺化或羟基的氰基化而获得的。
411、根据优选的实施方案，β-葡聚糖或甘露聚糖被氧化至一定的氧化度，该氧化度被定义为与schiff品红试剂的反应性，其对应于等量石耳聚糖被高碘酸盐氧化的氧化度，摩尔比为0.2-2.6，优选0.6-1.4，尤其0.7-1。
412、优选地，所述偶联物通过基于腙的偶联将酰肼与羰基(醛)偶联，或通过利用异双功能马来酰亚胺-和-酰肼接头(例如：bmph(n-β-马来酰亚氨基丙酸酰肼、mpbh(4-[4-n-马来酰亚氨基苯基]丁酸酰肼)、emch(n-[ε-马来酰亚氨基己酸)酰肼)或kmuh(n-[κ-马来酰亚氨基十一烷酸]酰肼)将巯基(例如：半胱氨酸)与羰基(醛)偶联)偶联而产生。
413、将要偶联至本发明clec的多肽是或包含至少一个b细胞或至少一个t细胞表位。优选地，偶联到clec的多肽包含单个b细胞或t细胞表位(即使在不止一个多肽偶联到该clec多糖骨架的实施例中)。如实施例章节所示，多肽的优选长度为5-29个氨基酸残基，优选5-25个，更优选7-20个，甚至更优选7-15个，尤其是7-13个氨基酸残基。在这方面，重要的是要注意，这些长度范围仅针对表位序列，不包括接头，所述接头包括肽接头，例如半胱氨酸或甘氨酸或双、三、四(或更长)聚肽基团，如cg或cg，或切割位点，例如组织蛋白酶切割位点；或其组合(例如-nrrac)。表位的示例已在实施例章节中测试；从这些结果可以看出，本发明的平台不限于任何特定多肽。因此，几乎所有可能的表位都适用于本发明，包括本领域已知的那些表位，尤其是那些已被描述为可整合到呈递平台中的表位(例如与“经典”载体分子或佐剂一起)。
414、表位若能基于现有偶联方法与活化的β-葡聚糖偶联，则是特别优选的，所述现有方法包括酰肼介导的偶联、经由异双功能接头(例如：bmph、mpbh、emch、kmuh等)的偶联、咪唑介导的偶联、还原胺化、碳二酰亚胺偶联等(更多内容待添加)。所用的表位包含单个的肽，可以包含在肽或蛋白质内，也可以被呈现为肽-蛋白质偶联物，再与clec偶联。
415、因此，用于提供本发明偶联物的优选偶联方法是酰肼偶联或利用硫酯形成进行的偶联(例如，利用bmph(n-β-马来酰亚氨基丙酸酰肼)、mpbh、emch、kmuh进行的马来酰亚胺偶联)，尤其是其中石耳聚糖通过腙形成与bmph偶联和多肽通过硫酯偶联。
416、在该实施方案中，优选提供具有两个优选接头的多肽，例如用于腙偶联的酰肼多肽/表位：
417、肽的n端偶联：h2n-nh-co-ch2-ch2-co-多肽-cooh；优选与琥珀酸或替代的合适接头组合，例如其他合适的二羧酸，尤其还有戊二酸用作间隔物/接头；
418、c末端偶联(是本发明优选的偶联方向)：nh2-多肽-nh-nh2。
419、或者，未经修饰的多肽/表位可应用在本发明中，例如，在c或n末端含有(额外)半胱氨酸残基或另一sh基团来源的多肽用于异双功能接头介导的偶联(特别是bmph、mpbh、emch、kmuh)：nh2-cys-pep-cooh或nh2-pep-cys-cooh。
420、本发明优选使用的b细胞多肽的长度为5-19个氨基酸残基，优选6-18个，尤其7-15个氨基酸残基。b细胞表位优选为短的线性多肽、糖多肽、脂多肽、其他翻译后修饰的多肽(例如：磷酸化、乙酰化、硝化、含有焦谷氨酸残基、糖基化等)、环状多肽等。
421、优选的b细胞表位是代表自身抗原的b细胞表位，代表肿瘤疾病中存在的抗原的b细胞表位，代表过敏性、ige介导的疾病中存在的抗原的b细胞表位，代表自身免疫病中存在的抗原的b细胞表位，代表传染病中存在的抗原的b细胞表位，代表构象表位的b细胞表位，代表碳水化合物表位的b细胞表位，固定/偶联至多肽或蛋白质形成适于clec偶联的多价b细胞表位-蛋白质/多肽偶联物包括载体分子如crm197、klh、破伤风类毒素或其他市售载体蛋白或本领域技术人员已知的载体(优选crm197和klh，最优选crm197)的b细胞表位；可与石耳聚糖/clec上存在的活性醛偶联的非肽源性抗原(包括线性多肽、代表构象表位的多肽、来自天然表位/序列的模拟表位或多肽变体、糖多肽、脂多肽、其他翻译后修饰的肽(例如：磷酸化、乙酰化、含有焦谷氨酸残基等)、环状多肽等)。
422、本发明优选使用的t细胞多肽的长度为8-30个氨基酸残基，优选13-29个氨基酸残基，更优选13-28个氨基酸残基。
423、本发明使用的t细胞表位的优选特异性是适合或已知适合通过mhc i和ii呈递(如本领域技术人员已知)的线性短肽，尤其是用于cd4效应t细胞和cd4treg细胞的mhcii表位，用于细胞毒性t细胞(cd8+)和cd8 treg细胞的mhci表位，例如可用于癌症、自身免疫或传染病，且在人或动物中已知有效；适合通过mhc i和ii(如本领域技术人员已知)呈递的线性短肽，其在n端或c端添加溶酶体蛋白酶切割位点，具体为组织蛋白酶家族成员特异性位点，更具体地为半胱氨酸组织蛋白酶的位点，如组织蛋白酶b、c、f、h、k、l、o、s、v、x和w，尤其是组织蛋白酶s-或l-，最优选为组织蛋白酶l切割位点，促进肽的有效内/溶酶体释放，用于mhc呈递，尤其是mhcii，以在人类或动物中已知的效力。各种蛋白质中的组织蛋白酶切割位点已被鉴定出，并为本领域所熟知。这包括序列或鉴定此类序列的方法的文献：例如：biniosek等，j.proteome res.2011,10,12,5363-5373；adams-cioaba等，naturecomm.2011,2:197；ferrall-fairbanks protein science 2018vol 27:714-724；kleine-weber等，scientific reports(2018)8:1659，https://en.wikipedia.org/wiki/cathepsin_s等。具体而言，如本发明所示用人工蛋白酶切割位点对肽序列进行的调适，是基于这些序列延伸的惊人效果：当抗原与clec偶联时，本发明clec疫苗经皮肤施用后，引发更有效的免疫应答。本发明的疫苗被树突细胞摄入，随后肽抗原被溶酶体加工并呈递至mhc。
424、溶酶体是细胞内的膜结合型细胞器，其特征是内部呈酸性，携有多种水解酶，包括脂肪酶、蛋白酶和糖苷酶，它们参与细胞分解代谢。在溶酶体所携的多种酶中，组织蛋白酶(cathepsin)是一种具有广谱功能的溶酶体蛋白酶家族。所有组织蛋白酶分为三个不同的蛋白酶家族：丝氨酸蛋白酶(组织蛋白酶a和g)、天冬氨酸蛋白酶(组织蛋白酶d和e)和11种半胱氨酸组织蛋白酶。在人类中，已知有11种半胱氨酸组织蛋白酶，其也有与木瓜蛋白酶相似的结构：组织蛋白酶b、c(j、二肽基肽酶i或dppi)、f、h、k(o2)、l、o、s、v(l2)、x(p、y、z)和w(淋巴蛋白酶)。
425、各种组织蛋白酶在细胞定位和生物合成方面表现出相似性，但表达模式有一些差异。在所有溶酶体蛋白酶中，组织蛋白酶l、b和d最为丰富，它们的溶酶体浓度相当于1mm。组织蛋白酶b、h、l、c、x、v和o被普遍表达，而组织蛋白酶k、s、e和w则表现出细胞或组织特异性表达。组织蛋白酶k在破骨细胞和上皮细胞中表达。组织蛋白酶s、e和w主要在免疫细胞中表达。
426、除了在溶酶体蛋白质再循环中发挥主要作用外，组织蛋白酶还在各种生理过程中发挥重要作用。组织蛋白酶s是参与mhc ii抗原加工和呈递的主要蛋白酶。无组织蛋白酶s的小鼠在生成mhc ii结合型li片段和呈递方面表现出显著差异，因为在组织蛋白酶s大量表达之处，专业apc中的li降解显著减少。此外，内吞作用选择性地将外源物质靶向人类树突细胞中的组织蛋白酶s。晚期内吞结构中mhc ii分子的富集也持续可见于缺乏组织蛋白酶s的小鼠的脾dc中。最近的研究表明，组织蛋白酶b和d都参与其中，但对mhc ii介导的抗原呈递并非必不可少。组织蛋白酶l也在广泛多种细胞过程中发挥作用，包括抗原加工、肿瘤侵袭和转移、骨吸收、以及参与生长调节的胞内蛋白和分泌蛋白的周转(turnover)。虽然组织蛋白酶l通常被认为是溶酶体蛋白酶，但它也是分泌型酶。这种广谱蛋白酶能有效降解多种细胞外蛋白(层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白i和iv、弹性蛋白、以及基底膜的其他结构蛋白)以及血清蛋白、细胞质蛋白和细胞核蛋白。
427、作为增强疫苗(特别是clec基疫苗)中t细胞表位效力的新手段，在n端或c端添加溶酶体蛋白酶裂解位点是本发明的优选实施方案。
428、根据本发明的此类切割位点可具有如下特征：
429、组织蛋白酶l样裂解位点：
430、预期的组织蛋白酶l样裂解位点是根据本领域已知的蛋白酶切割位点序列，特别是biniossek等(j.proteome res.2011,10,5363-5373)和adams-cioaba等(naturecomm.2011,2:197)中公开的那些来定义的。位点的取向可以是n端的或c端的，优选c端的。c端组织蛋白酶l位点的优选共有序列由下式组成：
431、xn-x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8
432、xn：来自免疫原性肽的3-27个氨基酸
433、x1：任意氨基酸
434、x2：任意氨基酸
435、x3：任意氨基酸
436、x4：n/d/a/q/s/r/g/l；优选n/d，更优选n
437、x5：f/r/a/k/t/s/e；优选f或r，更优选r
438、x6：f/r/a/k/v/s/y；优选f或r，更优选r
439、x7：任意氨基酸，优选a/g/p/f，更优选a
440、x8：半胱氨酸或接头像nhnh2
441、最优选序列：xn-x1 x2 x3 nrra-接头
442、组织蛋白酶s样裂解位点：
443、预期的组织蛋白酶s切割位点是基于本领域已知的蛋白酶切割位点序列，尤其还有biniossek等(j.proteome res.2011,10,5363-5373)和https://en.wikipedia.org/wiki/cathepsin_s中公开的那些，特征在于共有序列：
444、xn-x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8
445、其中x的特征是
446、xn：来自免疫原性肽的3-27个氨基酸
447、x1：任意氨基酸
448、x2：任意氨基酸
449、x3：任意氨基酸，优选v、l、i、f、w、y、h，更优选v
450、x4：任意氨基酸，优选v、l、i、f、w、y、h，更优选v
451、x5：k、r、e、d、q、n，优选k、r，更优选r
452、x6：任意氨基酸
453、x7：任意氨基酸，优选a
454、x8：优选a
455、x8：半胱氨酸或接头像nhnh2
456、最优选序列：xn-x1 x2 vvraa-接头
457、包含在蛋白质内的t细胞表位，其中所述蛋白质适合偶联至clec包括载体蛋白，尤其是白喉毒素(crm)的无毒交叉反应物质，尤其是crm 197,klh,白喉类毒素(dt),破伤风类毒素(tt),流感嗜血杆菌蛋白d(hipd),b群脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(ompc),重组无毒形式的铜绿假单胞菌外毒素a(repa),鞭毛蛋白,大肠杆菌热不稳定肠毒素(lt),霍乱毒素(ct),突变毒素(例如ltk63和ltr72),病毒样粒子,白蛋白结合蛋白,牛血清白蛋白,卵清蛋白,合成肽树枝状聚合物，例如多重抗原肽(map)或其他市售载体蛋白，优选crm197和klh，最优选crm197，优选偶联物中载体蛋白与β-葡聚糖的比例为1/0.1至1/50，优选为1/0.1至1/40，更优选为1/0.1至1/20，尤其是1/0.1至1/10。
458、根据本发明的优选实施方案，本发明的clec偶联物包含(a)clec偶联至单独的b-和/或t-细胞表位，包括多个b-或t-细胞表位的混合物，尤其是与石耳聚糖偶联的这些表位；(b)clec偶联至多肽-载体蛋白偶联物，优选多肽-klh或多肽crm197偶联物与石耳聚糖偶联，最优选多肽-crm197偶联物与石耳聚糖偶联；(c)clec与来自自身蛋白(癌症)或病原体(传染病)的单个的b-和t-细胞表位偶联，并非混杂的mhc/hla特异性而是已知的疾病特异性t细胞表位；与clec偶联，最优选与石耳聚糖偶联；(d)clec单个地(“单个地”在此是指，多肽链不是以融合蛋白、串联重复多肽或肽-蛋白偶联物的形式存在，而是作为独立的实体存在；即一个独立的含有b细胞表位的多肽和一个独立的含有t细胞表位的多肽)偶联至具有包含在多肽或蛋白质内的b细胞表位和t细胞表位，例如载体蛋白，自身蛋白，来自病原体、过敏原等的外来蛋白；(e)clec单个地(“单个地”，也具有与(d)相同的含义)偶联至与代表线性mhci和mhcii表位的t细胞表位或包含在蛋白质内的t细胞表位，例如载体蛋白或靶蛋白，例如用于治疗肿瘤疾病或自身免疫病。
459、鉴于本发明偶联物的这些有利特性，本发明的偶联物和疫苗特别适用于主动抗aβ、抗tau和/或抗α突触核蛋白的疫苗，用于治疗和预防β-淀粉样变性、tau蛋白病或突触核蛋白病，优选帕金森病(pd)、路易体痴呆(dlb)、多系统萎缩(msa)、帕金森病痴呆(pdd)、神经轴突营养不良、阿尔茨海默病(ad)、杏仁核限制性路易体痴呆(ad/alb)、唐氏综合征痴呆，皮克(pick)病、进行性核上性麻痹(psp)、皮层基底节变性、与第17条染色体关联的额颞叶痴呆和帕金森病(ftdp-17)和嗜银性谷物病。
460、因此，本发明的偶联物特别适用于预防或治疗疾病，例如用于人类、哺乳动物或鸟类，尤其是用于治疗和预防人类疾病。因此，本发明的一个方面是将本偶联物用在医学领域作为医学适应症的用途。本发明涉及本发明的偶联物用于治疗或预防疾病。本发明因此还涉及本发明的偶联物用于制备预防或治疗疾病的药物的用途，优选用于预防或治疗传染病、慢性疾病、过敏症或自身免疫病。相应地，本发明还涉及用于预防或治疗疾病的方法，优选用于预防或治疗传染病、慢性疾病、过敏症或自身免疫病，其中将有效量的本发明偶联物施用给有需要的患者。
461、根据另一方面，本发明的新型糖偶联物可用于预防传染病；优选的条件是，排除通过提供以(1,6)-偶联单糖部分与非β-(1,6)-偶联单糖部分的比例至少为1:1的主要为线性的β-(1,6)-葡聚糖作为抗原(最终与载体蛋白偶联)来预防或治疗由真菌(尤其是白色念珠菌)直接或间接引起的疾病。此类疾病例如是微生物感染，例如由乙型流感嗜血杆菌(hib)、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌和伤寒沙门氏菌或其他感染因子引起。
462、根据另一方面，本发明还涉及药物组合物，其包含上述偶联物或疫苗以及药学上可接受的载体。
463、优选地，药学上可接受的载体是缓冲剂，优选磷酸盐或tris基缓冲剂。
464、根据本发明的优选实施方案，所述药物组合物包含在基于针的递送系统中，优选注射器、微型针系统、空心针系统、实心微针系统、或包含针适配器的系统；安瓿、无针注射系统，优选喷射注射器；贴剂、透皮贴剂、微结构透皮系统、微针阵列贴剂(map)，优选固体map(s-map)、涂层map(c-map)或溶解性map(d-map)；电泳系统、离子电渗系统、基于激光的系统，尤其是铒yag激光系统；或基因枪系统中。本发明的偶联物不限于任何形式的生产、储存或递送状态。因此，所有传统和典型的形式均适用于本发明。优选地，本发明的组合物可以将本发明的偶联物或疫苗包含为溶液或悬浮液、深冻溶液或悬浮液；冻干物、粉末或颗粒。
465、本发明通过下列实施例和附图进一步说明，但不限于此。
1.一种偶联物，包含β-葡聚糖以及b细胞和/或t细胞表位多肽，其中β-葡聚糖与b细胞和/或t细胞表位多肽共价偶联，形成β-葡聚糖与b细胞和/或t细胞表位多肽的偶联物，其中β-葡聚糖是主要为线性的β-(1,6)-葡聚糖，且(1,6)-偶联的单糖部分与非β-(1,6)-偶联的单糖部分的比率为至少1:1，优选至少2:1，更优选至少5:1，尤其是至少10:1。
2.根据权利要求1所述的偶联物，其中所述β-葡聚糖是石耳聚糖。
3.根据权利要求1或2的偶联物，其中所述多肽包含至少一个b细胞表位和至少一个t细胞表位。
4.根据权利要求1～3中任一项的偶联物，其中偶联物中β-葡聚糖与b细胞和/或t细胞表位多肽的比例为10:1(w/w)～1:1(w/w)，优选为8:1(w/w)～2:1(w/w)，尤其是4:1(w/w)。
5.根据权利要求1～4中任一项的偶联物，其中b细胞表位和泛-特异性/混杂性t细胞表位独立地与β-葡聚糖偶联。
6.根据权利要求1～5中任一项的偶联物，其中b细胞表位多肽的长度为5～20个氨基酸残基，优选为6～19个氨基酸残基，尤其是7～15个氨基酸残基。
7.根据权利要求1～6中任一项的偶联物，其中t细胞表位多肽的长度为8～30个氨基酸残基，优选为13～29个氨基酸残基，尤其是13～28个氨基酸残基。
8.根据权利要求1～7中任一项的偶联物，其中所述偶联物还包含载体蛋白，优选白喉毒素(crm)的无毒交叉反应物质(尤其是crm197)、klh、白喉类毒素(dt)、破伤风类毒素(tt)、流感嗜血杆菌蛋白d(hipd)、脑膜炎球菌b血清群的外膜蛋白复合物(ompc)、重组无毒型铜绿假单胞菌外毒素a(repa)、鞭毛蛋白、大肠杆菌热不稳定肠毒素(lt)、霍乱毒素(ct)、突变毒素(例如ltk63和ltr72)、病毒样粒子、白蛋白结合蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、合成肽树枝状体如多抗原肽(map)，条件是，当偶联物包含载体蛋白时，偶联物包含至少另外的、独立偶联的t细胞或b细胞表位多肽，尤其是偶联物中载体蛋白与β-葡聚糖的比例为1/0.1～1/50，优选1/0.1～1/40，更优选1/0.1～1/20，特别是从1/0.1～1/10。
9.根据权利要求1～8中任一项的偶联物，其中所述多肽是或者包含b细胞表位多肽或t细胞表位多肽，优选所述多肽是或者包含b细胞表位和t细胞表位。
10.根据权利要求1～8中任一项的偶联物，其中所述偶联物包含t细胞表位并且不含b细胞表位，其中所述偶联物优选包含一个以上的t细胞表位，特别是两个、三个、四个或五个t细胞表位。
11.根据权利要求1～10中任一项的偶联物用于预防或治疗疾病的用途，优选用于预防或治疗传染病、慢性病、过敏症或自身免疫病。
12.根据权利要求1～11中任一项的偶联物的用途，用作主动抗-aβ、抗-tau和/或抗-α突触核蛋白疫苗，用于治疗和预防β-淀粉样变性、tau蛋白病、或突触核蛋白病，优选帕金森病(pd)、路易体痴呆(dlb)、多系统萎缩(msa)、帕金森病痴呆(pdd)、神经轴突营养不良、阿尔茨海默病(ad)、杏仁核限制性路易体ad(ad/alb)、唐氏综合征痴呆、皮克病、进行性核上性麻痹(psp)、皮层基底节变性、与第17条染色体相关的额颞叶痴呆和帕金森病(ftdp-17)以及嗜银性谷物病。
13.制备根据权利要求1～12中任一项的偶联物的方法，其中β-葡聚糖通过氧化作用活化，并且其中活化的β-葡聚糖与b细胞表位多肽和/或t细胞表位多肽接触，从而获得β-葡聚糖与b细胞表位多肽和/或t细胞表位多肽的偶联物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中β-葡聚糖是通过在邻羟基上进行高碘酸盐氧化、作为还原胺化、或作为羟基的氰基化而获得的。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中β-葡聚糖被氧化至一定的氧化度，该氧化度定义为与schiff品红试剂的反应性，对应于用高碘酸盐以0.2-2.6、优选0.6-1.4、尤其是0.7-1的摩尔比氧化等量石耳聚糖的氧化度。
