本发明涉及重组载体、及包括其的基因传递系统、重组病毒和转化体。
背景技术：
1、基因治疗是指利用基因的治疗技术，诸如将新的基因插入患者的细胞、剔除工作不正常的基因、或者用正常基因替换发生了突变的基因。这样的基因治疗可在只识别到引起疾病的基因时立即靶向化，与其它抗体或化合物治疗剂相比，可以快速、低廉地进行制造，可以提高利用现有药物治疗剂难以治疗的疾病的治疗可能性。
2、为了有效的基因治疗，首选应找到对疾病治疗重要的靶向基因，开发将其良好地传递到细胞内而无副作用的载体(vector)的技术是必须的。载体是基因传递体，大致可分为病毒载体和非病毒载体。病毒性传递体是通过去除病毒基因的大部分或部分必需基因，使其无法自行复制，并在其中插入治疗基因而制造的，虽然可以高效低将基因传递到细胞内，但根据病毒的种类，存在诸如大量生产的困难、诱发免疫反应、毒性、可复制病毒的出现等的问题。目前，作为用于基因治疗剂开发的主要病毒性传递体，有逆转录病毒(retrovirus)、慢病毒(lentivirus)、腺病毒、腺相关病毒(adeno-associated virus)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、痘病毒(pox virus)等。另一方面，非病毒性传递体是指脂质体、质粒等，不诱导免疫反应，毒性低，易于大量生产，但基因传递效率低，其表达是暂时性的，因此限制了基因治疗剂的开发。
3、在基因治疗剂开发中，利用腺相关病毒或逆转录病毒的载体技术是主流。作为逆转录病毒的一种的慢病毒无论细胞如何分裂，都能够进行基因传递，并且传递的基因所插入的染色体的位置分布在“oncogenic insertional mutagenesis(基因插入致癌)”风险相对较低的区域，通过删除3'ltr(long terminal repeat，长末端重复)的u3部分而诱导自身失活(self inactivating)，从而优点在于，可以从根本上阻断可由ltr引起的肿瘤原性的危险性。
4、然而，可以导入病毒载体的目的基因的大小是有限的，并且随着目的基因的大小增加，目的基因由于同源重组(homologous recombination)而消失的可能性增加。此外，根据细胞的种类和状态，一个载体中包含的多数的目的基因可能不均地沉默(silencing)，这样的沉默现象用现有技术难以预测或预防。因此，构建在细胞(例如间充质干细胞)中均匀表达两种以上的目的基因而不沉默的载体并不容易，迫切需要对其进行研究。
5、现有技术文献
6、专利文献
7、韩国授权专利第10-1885438号
技术实现思路
1、本发明的目的在于，提供一种可以将两个以上的目的基因传递到细胞内并稳定表达的重组载体。
2、另外，本发明的目的在于提供包括上述重组载体的基因传递系统。
3、另外，本发明的目的在于提供包括上述重组载体的重组病毒。
4、另外，本发明的目的在于提供导入有上述重组载体或重组病毒的转化体。
5、本发明的的一个方式提供一种重组载体，其包括cte、第一目的基因、第一启动子、第二启动子和第二目的基因，上述第一目的基因和第一启动子是反向的。
6、本发明中所使用的“载体(vector)”作为可以在合适的宿主细胞中表达目的基因的表达载体，是指为了表达载体内包含的基因插入物而包括可操作地连接的必需的调控元件的基因产物。在这里，“可操作地连接的(operably linked)”是指执行一般的功能的核酸表达调控序列和编码目的基因的核酸序列功能性地连接(functional linkage)。
7、根据本发明的载体除了启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号、增强子(enhancer)等表达调控元件以外，也包括用于膜靶向或分泌的信号序列或前导序列，并且可以根据目的以多种方式制造。载体的启动子可以是组成型或诱导型的。此外，表达载体包括用于选择含有载体的宿主细胞的选择标记，在为可复制的表达载体时，可以包括复制起点。这样的载体可以自我复制或整合到宿主dna中。作为上述载体的一个例子，有质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。
8、这样的包括cte、第一目的基因、第一启动子、第二启动子和第二目的基因的重组载体通过包含两个目的基因和调控各个目的基因的表达的两个启动子，从而可以在一个载体中同时表达两个目的基因。
9、另外，根据本发明的重组载体通过进一步包含目的基因和调控其表达的启动子，从而可以在一个载体中同时表达3个目的基因。
10、根据本发明的一具体例，上述重组载体还可以包括第三启动子和第三目的基因。
11、本发明中使用的“cte(constitutive transport element，构型转运因子)”是指促进不完全剪接mrna的核外运输(nuclear export)的因子，已知其越靠近对mrna的核外运输、翻译和稳定性重要的多聚a尾(poly a tail)，其功能越越提升，从而增加目的基因的表达(mr mautino,et al.,gene therapy.2000.7,1421-1424)。
12、本发明中使用的“目的基因(target gene)”是指由启动子诱导表达的基因。
13、本发明中使用的“启动子(promoter)”参与参与rna聚合酶的结合，使其可以作为dna的一部分启动转录。通常与目的基因相邻并位于其上游(upstream)，作为诱导rna聚合酶或rna聚合酶的蛋白质即转录因子(transcription factor)结合的位点，可以诱导上述酶或蛋白质位于正确的转录起始位点。即，位于有义链(sense strand)上待转录基因的5'位点，诱导rna聚合酶直接或通过转录因子结合到相应位点以启动目的基因的mrna合成，具有特定的基因序列。
14、上述重组载体的元件，即cte、目的基因和启动子可能根据连接方向影响目的基因的表达。
15、根据本发明的一具体例，上述cte可以连接到多聚a尾(poly atail)的3'末端。
16、根据本发明的一具体例，上述cte可以包含由seq id no:1表示的碱基序列。
17、根据本发明的一具体例，上述cte可以是正向或反向的。
18、本发明中使用的“正向(forward orientation)”是指病毒基因内各基因编码的序列处于有义方向(sense orientation；5'→3')，“反向(reverse orientation)”是指病毒基因内由各基因编码的序列处于反义方向(anti-sense orientation；3'→5')。
19、根据本发明的重组载体为了同时表达两个以上的目的基因，包含诱导各目的基因的表达的两个以上的启动子，在这里，两个以上的启动子各自的种类可以相同或彼此不同。
20、在这样的重组载体中，除了反向的第一目的基因和第一启动子以外的第二目的基因和第二启动子和/或第三目的基因和第三启动子可以正向连接。
21、根据本发明的一具体例，上述启动子可以为选自猿猴病毒40(simian virus 40，sv40)启动子、巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)启动子、最小(minimal)cmv启动子、人类泛素c(ubiquitin c promoter，ubc)启动子、人类延伸因子1a(human elongation factor1a，ef1a)启动子、磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1，pgk)启动子和巨细胞病毒极早期增强子/鸡β-肌动蛋白(cytomegalovirus immediate-early enhancer/chickenβ-actin，cag)杂合启动子中的1种以上。
22、根据本发明的第一启动子、第二启动子和第三启动子为了提高各目的基因的表达而优选彼此不同。
23、作为一个例子，上述第一启动子、第二启动子和第三启动子可以选自cag启动子(seq id no:2)、最小(mimimal)cmv(以下称为“mcmv”)(seq id no:3)、pgk启动子(seq idno:4)和sv40(启动子5)。
24、更具体而言，上述第一启动子和第二启动子分别可以为cag启动子和mcmv启动子、mcmv启动子和cag启动子、pgk启动子和mcmv启动子、或mcmv启动子和pgk启动子。在这里，第一启动子是反向连接的。
25、根据本发明的一具体例，上述目的基因可以为选自疾病治疗用基因、报告基因、选择标记基因和细胞标记基因中的1种以上。
26、根据本发明的重组载体可以同时表达两个以上的目的基因，因此可以将表达疾病治疗用基因、报告基因或选择标记基因分别进行表达或者将疾病治疗用基因、报告基因和选择标记基因全部进行表达。
27、本发明中使用的“疾病治疗用基因”是指编码对癌症等异常表达基因的细胞表现出治疗效果的多肽的多核苷酸序列或碱基序列。
28、根据本发明的一具体例，上述疾病治疗用基因可以为选自药物敏感性基因、细胞凋亡基因、细胞增殖抑制基因、细胞生长基因、细胞毒性基因、肿瘤抑制因子基因、抗原性基因、细胞因子基因、神经生成基因、抗新生血管生成基因和激素基因中的1种以上。
29、上述药物敏感性基因(drug-sensitizing gene)是编码将无毒的前体(prodrug)转化为有毒物质的酶的基因，由于使导入有该基因的细胞凋亡，因此又称为自杀基因(suicide gene)。即，当局部或全身施用对正常细胞无毒的前体时，前体可以只在靶细胞中转化为毒性代谢物，从而改变药物敏感性并破坏靶细胞。作为这样的药物敏感性基因的一个例子，有利用更昔洛韦(ganciclovir)或缬更昔洛韦(valganciclovir)作为前体的hsv-tk(herpes simplex virus-thymidine kinase，单纯疱疹病毒胸苷激酶)基因、以5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-fc)为前体的大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)等，但并不限定于此。
30、上述细胞凋亡基因(proapoptotic gene)是表达时诱导程序性细胞凋亡的核苷酸序列。作为这样的细胞凋亡基因的一个例子，有p53、腺病毒e3-11.6k(来源于ad2和ad5)或腺病毒e3-10.5k(来源于ad)、腺病毒e4基因、p53途径基因和编码半胱天冬酶的基因等，但并不限定于此。
31、上述细胞增殖抑制基因(cytostatic gene)是在细胞内表达并在细胞周期期间使细胞周期停滞的核苷酸序列，作为其的一个例子，有p21、视网膜母细胞瘤基因、e2f-rb融合蛋白质基因、编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的基因(例如p16、p15、p18和p19)、生长终止特异性同源盒(growth arrest specific homeobox，gax)基因等，但并不限定于此。
32、上述细胞生长基因(cell growth gene)是促进干细胞或已完成分化的细胞的分裂、生长和分化的核苷酸序列。作为这样的细胞生长基因的一个例子，有肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor)、干细胞因子(stem cell factor)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor)、表皮生长因子(epidermal growth factor)、成纤维细胞生长因子(fibroblastic growth factor)、神经生长因子(nerve growth factor)、转化生长因子(transforming growth factor)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growthfactor)、骨源性生长因子(bone-derived growth factor)、集落刺激因子(colonystimulation factor)等，但并不限定于此。
33、上述细胞毒性基因(cytotoxic gene)是在细胞内表达并表现出毒性效果的核苷酸序列，作为其的一个例子，有编码假单胞菌外毒素(exotoxin)、蓖麻毒素、白喉毒素等的核苷酸序列等，但并不限定于此。
34、上述肿瘤抑制因子基因(tumor suppressor gene)是指在靶细胞内表达并可以抑制肿瘤表型或诱导细胞凋亡的核苷酸序列。作为这样的肿瘤抑制因子基因的一个例子，有肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor-α)基因、p53基因、apc基因、dpc-4/smad4基因、brca-1基因、brca-2基因、wt-1基因、视网膜母细胞瘤基因、mmac-1基因、mmsc-2基因、nf-1基因、位于染色体3p21.3的鼻咽肿瘤抑制因子基因、mts1基因、cdk4基因、nf-1基因、nf-2基因、vhl基因、pd-1(programmed death-1，程序性凋亡-1)基因等，但并不限定于此。
35、上述抗原性基因(antigenic gene)是在靶细胞内表达并产生可以被免疫系统识别的细胞表面抗原性蛋白质的核苷酸序列，作为其的一个例子，有癌胚抗原(carcinoembryonic antigen)、p53等，但并不限定于此。
36、上述细胞因子基因(cytokine gene)是指在细胞内表达并产生细胞因子的核苷酸序列，作为其的一个例子，有gmcsf、白细胞介素(例如il-1、il-2、il-4、il-6、il-12、il-10、il-15、il-19、il-20)、干扰素(例如α、β、γ)等，但并不限定于此。
37、上述神经生成基因(neurogenic gene)是促进神经的产生和发育的核苷酸序列，作为其的一个例子，有脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor)、神经生长因子(nerve growth factor)等，但并不限定于此。
38、上述神经分化基因(neuronal differentiation gene)是参与神经上皮细胞在干细胞细胞分裂中分裂成神经母细胞(neuroblast)和神经胶质细胞(neuroglia)的核苷酸序列，作为其的一个例子，有神经原素(neurogenin)、neurod、ascl1(achaete-scute homolog1)等，但并不限定于此。
39、上述抗新生血管生成基因(anti-angiogenic gene)是指表达并将抗新生血管生成因子释放到细胞外的核苷酸序列，作为其的一个例子，可以为血管抑制素、血管内皮生长因子(vegf)的抑制因子、内皮抑素等，但并不限定于此。
40、上述激素基因(hormone gene)是指产生激素或其前体的核苷酸序列，作为其的一个例子，有胰岛素(insulin)、生长激素(growth hormone)、促甲状腺激素(thyroidstimulating hormone)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone)、促性腺激素(gonadotropic hormone)、催乳素(prolactin)、促黄体激素(luteotropic hormone)、黑色素细胞刺激激素(melanocyte stimulating hormone)、加压素(vasopressin)和催产素(oxytocin)等，但并不限定于此。
41、除此以外，只要是具有治疗效果的基因就可以使用而没有是否为疾病治疗用基因的限制。
42、本发明中使用的“报告基因(reporter gene)”适用于检测重组载体是否导入或目的基因的表达效率的基因，只要是可以检测而不损坏感染的细胞或组织的基因就可以使用而不受限制。
43、根据本发明的一具体例，上述报告基因可以为选自tdtomato、荧光素酶(luciferase)、羽小角水蚤(pontellina plumata)分离的copgfp、从维多利亚多管发光水母(aequorea victoria)分离的绿色荧光蛋白(gfp)、修饰的绿色荧光蛋白(mgfp)、增强的绿色荧光蛋白(egfp)、红色荧光蛋白(rfp)、修饰的红色荧光蛋白(mrfp)、增强的红色荧光蛋白(erfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)、修饰的蓝色荧光蛋白(mbfp)、增强的蓝色荧光蛋白(ebfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、修饰的黄色荧光蛋白(myfp)、增强的黄色荧光蛋白(eyfp)、青色荧光蛋白(cfp)、修饰的青色荧光蛋白(mcfp)和增强的青色荧光蛋白(ecfp)中的1种以上，但并不限定于此。
44、本发明中使用的“选择标记基因(selection marker gene)”是用于选择导入有基因细胞的抗生素抗性基因(antibiotic resistance gene)，由于在用抗生素处理的培养基中只有表达选择标记基因即抗生素抗性基因的细胞可以存活，因此可以进行导入有基因的细胞的筛选。作为上述选择标记基因，可以使用本技术领域中公知的抗生素抗性基因而不受限制。
45、根据本发明的一具体例，上述选择标记基因可以为选自β-内酰胺酶(beta-lactamase)、嘌呤霉素n-乙酰转移酶(puromycin n-acteyltransferase)和氨基糖苷磷酸转移酶(aminoglycoside phosphotransferase)、潮霉素b-磷酸转移酶(hygromycin bphosphotransferase)中的1种以上，但并不限定于此。
46、本发明中使用的“细胞标记基因(cell marker gene)”是编码在细胞膜或细胞表面特异性表达的诸如多肽、蛋白质、脂质、糖脂、糖蛋白质、糖等分子的多核苷酸序列或碱基序列。
47、根据本发明的一具体例，上述细胞标记基因可以为选自na/i同向转运体(sodium/iodide symporter)、thy-1细胞表面抗原(cell surface antigen)(cd90)、cd3、cd4、cd8和cd25中的1种以上，但并不限定于此。
48、这样的目的基因可以用人类密码子进行优化。其中，“用人类密码子优化”是指在宿主细胞内，当dna转录和翻译成蛋白质时，指定氨基酸的密码子之间存在取决于宿主的偏好度高的密码子，意味着通过用人类的密码子进行置换使其核酸编码的氨基酸或蛋白质的表达效率增加。
49、作为一个例子，上述第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因可以选自hgf基因(seq id no:6)、ngn1基因(seq id no:7或8)、hsv-tk基因(seq id no:9或10)和嘌呤霉素抗性基因(seq id no:11)。
50、上述hgf基因是肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor)，是编码被已知是分散因子(scatter factor)或肝细胞凋亡素-a(hepatopoietin-a)的肝素结合糖蛋白质的基因。已知上述hgf由多种间充质细胞产生，促进细胞的增殖，调节内皮细胞(endothelialcell)的生长和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell)的移动，诱导血管新生(angiogenesis)。
51、上述ngn1基因是编码专门参与神经分化的神经原素1(neurogenin 1)的基因。上述神经原素1起到调节骨形态发生蛋白(bone-morphogenetic-protein)和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)诱导神经分化的作用。上述ngn1基因可以包含由seq idno:7表示的碱基序列，在ngn1基因的5'末端附有标志(flag)时，可以为seq id no:8的碱基序列。
52、上述hsv-tk基因是编码单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，hsv)的胸苷激酶(thymidine kinase，tk)的基因。上述tk是使atp的γ位的磷酸与胸苷结合以促进胸苷酸生成反应的酶，已知除了胸苷以外，作为抗病毒剂的更昔洛韦(ganciclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)、阿昔洛韦(acyclovir)、伐昔洛韦(valacyclovir)等被磷酸化，磷酸化的产物扰乱dna复制，从而诱导细胞凋亡。
53、上述嘌呤霉素抗性基因(puror)是编码嘌呤霉素n-乙酰转移酶的基因。上述嘌呤霉素抗性基因与氨酰基(amynoacyl)t-rna相似，通过使干扰蛋白质翻译的嘌呤霉素失活以阻断嘌呤霉素的功能，从而用于诱导抗性并筛选导入有基因的细胞。
54、根据本发明的一具体例，上述重组载体的第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因中的一个以上可以包含kozak序列。
55、上述kozak序列是与原核生物的shine&dalgarno碱基序列对应的真核生物(eukaryote)的翻译起始决定位点，位于mrna的碱基序列中编码甲硫氨酸的密码子aug之前，并且其上附着核糖体。
56、根据本发明的一具体例，上述kozak序列可以包含ccacc或ccg cc。
57、作为一个例子，上述kozak序列可以包含由seq id no:12表示的碱基序列。
58、根据本发明的重组载体可以通过两个以上的启动子调控其上加载的两个以上的目的基因的表达，被设计成通过可操纵地连接启动子与由其表达的目的基因，从而通过一个启动子表达一个目的基因，因此可以在一个载体中同时翻译最多3个目标蛋白。
59、本发明的另一方式提供包含上述的重组载体的基因传递系统。
60、本发明中使用的“基因传递系统(gene delivery system)”是指可以通过提高将目的基因和/或核酸序列传递到细胞内部的效率来增加表达效率的系统，可以分为病毒介导协同和非病毒系统。
61、已知上述病毒介导系统使用诸如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体等的病毒性载体，利用引起人类细胞之类的真核细胞感染的病毒固有的细胞内渗透机制，与非病毒性系统相比，细胞内基因传递效率比较高。此外，非病毒性载体在进入细胞内后存在的问题在于，内体(endosome)与溶酶体融合后基因在内溶酶体中分解，但病毒性载体由于不通过溶酶体而直接将基因传递到核内的机制，优点在于，基因的损失小，基因传递效率高。
62、根据本发明的一具体例，上述基因传递系统可以使用病毒性载体。
63、更具体而言，上述病毒性载体可以来源于选自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和痘病毒中的1种以上，优选为慢病毒。
64、这样的病毒性载体组装到病毒粒子上后，可以通过感染(infection)之类的转导(transduction)方法被导入细胞内部。
65、根据本发明的基因传递系统通过执行将表达两个以上的目的基因的重组载体传递到目标细胞的功能，从而被传递到细胞内的重组载体的两个以上的目的基因可以通过细胞内转录系统表达。
66、本发明的另一方式提供包含上述的重组载体的重组病毒。
67、根据本发明的一具体例，上述重组病毒可以是慢病毒来源的。
68、这样的重组病毒可以靶向在在分裂的所有的细胞，具体而言，可以是免疫细胞或干细胞。
69、根据本发明的一具体例，上述免疫细胞可以选自或来源于中性粒细胞(neutrophil)、嗜酸性粒细胞(eosinophil)、嗜碱性粒细胞(basophil)、巨噬细胞(macrophage)、肥大细胞(mast cell)、树突状细胞(dendritic cell)、b淋巴细胞(blymphocyte)、t淋巴细胞(t lymphocyte)和nk细胞(natural killer cell)。
70、根据本发明的一具体例，上述干细胞可以为选自胚胎干细胞(embryonic stemcell)、胎儿干细胞(fetal stem cell)、成体干细胞(adult stem cell)、羊膜胚胎干细胞(amniotic stem cell)、脐带血干细胞(cord blood stem cell)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell)、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，msc)、神经干细胞(neural stem cell)、造血干细胞(hematopoietic stem cell)和癌症干细胞(cancer stem cell)中的1种以上。
71、本发明的另一方式提供导入有上述的重组载体或重组病毒的转化体。
72、本发明中使用的“转化体”是指将外源基因插入宿主细胞而制造的、用重组载体转化(transfection)或用重组病毒转导(transduction)的细胞，也称为重组宿主细胞、重组细胞或重组微生物。
73、本发明中使用的“宿主细胞”是指转化、转导或导入有重组载体或重组病毒的细胞。
74、上述宿主细胞可以为本技术领域中公知的宿主细胞。作为上述宿主细胞的一个例子，可以为ns/o骨髓瘤细胞(ns/o myeloma cell)、人类293t细胞、中国仓鼠卵巢细胞(chocell)、hela细胞、人类羊水来源的细胞(capt细胞)、cos细胞、犬源d17细胞、猫源pg4细胞、干细胞等等，并且不限定于此。
75、上述转化可以根据本技术领域中公知的生物学、化学或物理学方法将基因导入细胞内。作为上述转染的一个例子，可以通过选自脂质体法、显微注射法、磷酸钙沉淀法、电穿孔法、脂质体-介导转染法、deae-葡聚糖处理法、聚凝胺(polybrene)处理法、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)处理法和基因轰击法中的任一种或更多种方法进行。
76、上述转化体可以使用动物细胞培养中通常利用的培养基来培养。作为一个例子，上述培养基可以为选自eagles's mem、a-mem、iscove'smem、199培养基、cmrl 1066、rpmi1640、f12、f10、dmem、dmem和f12的混合培养基、way-mouth's mb752/1、mccoy's 5a和mcdb系列培养基中的任一种或更多种。
77、根据本发明的一具体例，上述转化体可以为免疫细胞或间充质干细胞。
78、上述免疫细胞是从造血干细胞中分化并参与免疫的细胞，可以选自或来源于中性粒细胞(neutrophil)、嗜酸性粒细胞(eosinophil)、嗜碱性粒细胞(basophil)、巨噬细胞(macrophage)、肥大细胞(mast cell)、树突状细胞(dendritic cell)、b淋巴细胞(blymphocyte)、t淋巴细胞(tlymphocyte)和nk细胞(natural killer cell)。
79、上述间充质干细胞是在受精卵分裂时从间充质分化为肌肉细胞(mus cle cell)、脂肪细胞(fat cell)、成骨细胞(osteoblast)、软骨细胞(chondrocyte)等的细胞。
80、上述间充质干细胞是保持干性(stemness)和自我更新能力(self renewal)并且具有可以分化为各种间充质组织的能力(可塑性(plasticity))的细胞，可以从骨髓(bonemarrow)、脂肪组织(adipose tissue)、脐带血(umbilical cord blood)、滑膜(synovialmembrane)、骨组织(骨小梁(trabecular bone))、髌下脂肪垫(infrapatellar fat pad)、胎盘(placenta)等中提取。这样的间充质干细胞具有如下的免疫调节能力，：1)抑制t淋巴细胞和b淋巴细胞的活性、增殖，2)抑制自然杀伤细胞(natural killer cell)的活性，3)调节树突状细胞(dendritic cell)和巨噬细胞(macrophage)的功能，因此可以实现同种移植(allotransplantation)和异种移植(xenotransplantation)，可用于治疗受损的关节软骨或神经。
81、更具体而言，上述转化体可以为来源于选自骨髓(bone marrow)、脂肪组织(adipose tissue)、脐带血(umbilical cord blood)、羊膜(amniotic membrane)、滑膜(synovial membrane)、骨组织(骨小梁(trabecular bone))和髌下脂肪垫(infrapatellarfat pad)中的任一者的间充质干细胞，但并不限定于此。
82、根据本发明的重组载体设计成由一个启动子表达一个目的基因，通过将两个以上的目的基因传递到细胞内，从而可以在一个载体中同时稳定地表达最多3个目的基因，因此可以将这样的重组载体有用地应用于高效的基因传递系统。
1.一种重组载体，包括cte、第一目的基因、第一启动子、第二启动子和第二目的基因，
2.根据权利要求1所述的重组载体，其中，所述重组载体还包括第三启动子和第三目的基因。
3.根据权利要求1所述的重组载体，其中，所述cte为具有seq id no:2的碱基序列的多核苷酸。
4.根据权利要求1所述的重组载体，其中，所述cte是正向或反向的。
5.根据权利要求1或2所述的重组载体，其中，所述启动子为选自猿猴病毒40启动子即sv40启动子、巨细胞病毒启动子即cmv启动子、最小cmv启动子、人类泛素c启动子即ubc启动子、人类延伸因子1a启动子即ef1a启动子、磷酸甘油酸激酶1启动子即pgk启动子、以及巨细胞病毒极早期增强子/鸡β-肌动蛋白启动子即cag启动子中的1种以上。
6.根据权利要求1或2所述的重组载体，其中，所述目的基因为选自疾病治疗用基因、报告基因、选择标记基因和细胞标记基因中的1种以上。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其中，所述疾病治疗用基因为选自药物敏感性基因、细胞凋亡基因、细胞增殖抑制基因、细胞生长基因、细胞毒性基因、肿瘤抑制因子基因、抗原性基因、细胞因子基因、神经生成基因、抗新生血管生成基因和激素基因中的1种以上。
8.根据权利要求6所述的重组载体，其中，所述报告基因为选自tdtomato、荧光素酶、从羽小角水蚤(pontellina plumata)分离的copgfp、从维多利亚多管发光水母(aequoreavictoria)分离的绿色荧光蛋白即gfp、修饰的绿色荧光蛋白即mgfp、增强的绿色荧光蛋白即egfp、红色荧光蛋白即rfp、修饰的红色荧光蛋白即mrfp、增强的红色荧光蛋白即erfp、蓝色荧光蛋白即bfp、修饰的蓝色荧光蛋白即mbfp、增强的蓝色荧光蛋白即ebfp、黄色荧光蛋白即yfp、修饰的黄色荧光蛋白即myfp、增强的黄色荧光蛋白即eyfp、青色荧光蛋白即cfp、修饰的青色荧光蛋白即mcfp和增强的青色荧光蛋白即ecfp中的1种以上。
9.根据权利要求6所述的重组载体，其中，所述选择标记基因为选自β-内酰胺酶、嘌呤霉素n-乙酰转移酶、潮霉素b-磷酸转移酶和氨基糖苷磷酸转移酶中的1种以上。
10.根据权利要求6所述的重组载体，其中，所述细胞标记基因为选自na/i同向转运体、thy-1细胞表面抗原即cd90、cd3、cd4、cd8和cd25中的1种以上。
11.根据权利要求1或2所述的重组载体，其中，所述重组载体的第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因中的一个以上包含kozak碱基序列。
12.一种基因传递系统，其包含权利要求1或2所述的重组载体。
13.一种重组病毒，其包含权利要求1或2所述的重组载体。
14.根据权利要求13所述的重组病毒，其中，所述重组病毒来源于慢病毒(lentivirus)。
15.一种转化体，其导入有权利要求1或2所述的重组载体或权利要求13所述的重组病毒。
16.根据权利要求15所述的转化体，其中，所述转化体为免疫细胞或间充质干细胞。
17.根据权利要求16所述的转化体，其中，所述免疫细胞选自或来源于中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞和nk细胞。
18.根据权利要求16所述的转化体，其中，所述间充质干细胞来源于选自骨髓、脂肪组织、脐带血、羊膜、滑膜、骨组织和髌下脂肪垫中的任一者。
