本发明属于发酵领域，具体涉及无需抗生素的产3’-唾液酸乳糖的工程菌及其构建方法及其应用。
背景技术：
1、人乳寡糖(human milk oligosaccharides，hmos)是存在于母乳中的一类重要低聚糖，由五种单体糖加乳糖分子在特异的糖基转移酶的作用下以各种不同的组合排列构成，目前已确定结构的hmos超过30多种。研究表明，hmos可以作为益生元影响肠道微生物群的内在成分，维持肠道微生物环境平衡；hmos及其代谢产物(如唾液酸等)在大脑发育、神经传递和突触形成中起着重要的作用，具有促进婴幼儿大脑发育及提高认知等方面的功能；此外，hmos还具有抗病毒、免疫调节和促进人体康复等作用。
2、目前主要发现的人乳寡糖的种类包括岩藻糖基化hmos和唾液酸化hmos。在唾液酸化的hmos中，唾液酸乳糖的含量最高，包含3’-唾液酸乳糖(3’-sialyllactose，3’-sl)和6’-唾液酸乳糖(6’-sialyllactose，6’-sl)，3’-sl和6’-sl分别是由唾液酸和乳糖作为前体物质以α-2,3或α-2,6糖苷键连接而成，3’-sl和6’-sl的结构式分别如式i和式ii所示：
3、
4、目前关于唾液酸乳糖的生产方法包括化学合成法、酶催化合成法等方式，化学合成法需要昂贵的原料、反应条件严苛、成本较高以及产率较低。相比化学合成法，酶催化合成法虽然具有较高的产率，但是酶催化反应需要使用昂贵的酶，故综合生产成本高，并且在酶催化反应中，酶较容易失活，从而影响到酶催化效率和产物的产率，故该方法也难以实现大规模生产。
技术实现思路
1、本发明为了克服现有技术的3’-唾液酸乳糖在合成时产量较低的问题，提供了无需抗生素且高产3’-唾液酸乳糖的工程菌及其构建方法和应用。
2、本文的大肠杆菌ebsl005菌株(又称slis109菌株)已经于2023年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmcc no.:28244，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；分类命名为大肠埃希氏菌(escherichia coli)。
3、在一个方面，本发明提供了一种基因工程菌，其具有产生3’-唾液酸乳糖的能力，并且具有udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)，其中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)彼此独立整合或以任意组合共同整合于所述基因工程菌的基因组中，或者，存在于所述基因工程菌携带的重组质粒中。
4、在一个实施方案中，基因工程菌具有引入的外源udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、外源唾液酸合酶基因(neub)、外源n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和外源α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)。其中，引入的外源udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、引入的外源唾液酸合酶基因(neub)、引入的外源n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和引入的外源α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)彼此独立整合或以任意组合共同整合于所述基因工程菌的基因组中，或者，存在于所述基因工程菌携带的重组质粒中。
5、在一个实施方案中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)以分别连接了单独的第一启动子和/或终止子的方式整合于所述基因工程菌的基因组中，或者存在于所述基因工程菌携带的重组质粒中。
6、在一个实施方案中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)中的任意2种、3种或4种基因以共同连接了第一启动子和/或终止子的方式整合于所述基因工程菌的基因组中，或者共同存在于所述基因工程菌携带的重组质粒中。
7、在一个实施方案中，所述第一启动子为t2启动子。在一个实施方案中，所述终止子为t7终止子。
8、在一个实施方案中，所述重组质粒以ptu2作为骨架质粒。
9、在一个实施方案中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)以各自分别连接了单独的第一启动子和/或终止子的方式作为一个基因组合，或者以共同连接了第一启动子和/或终止子的方式作为一个基因组合插入到基因工程菌的基因组的一个或多个插入序列1(is1)处。
10、在一个实施方案中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)作为一个基因组合在所述插入序列1(is1)处的拷贝数为10-28、12-26或14-22，例如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。
11、在一个实施方案中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶包含：如seq id no:82所示的氨基酸序列，或与seq id no:82所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
12、在一个实施方案中，唾液酸合酶包含：如seq id no:83所示的氨基酸序列，或与seq id no:83所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
13、在一个实施方案中，n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶包含：如seq id no:84所示的氨基酸序列，或与seq id no:84所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
14、在一个实施方案中，α-2,3-唾液酸转移酶包含：如seq id no:85所示的氨基酸序列，或与seq id no:85所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
15、在一个实施方案中，基因工程菌以一种或多种如下的方式进行了修饰：
16、(1)基因工程菌修饰为增加葡萄糖胺-6-磷酸的生成量；
17、(2)基因工程菌修饰为使胞苷-5’-三磷酸持续循环再生；
18、(3)基因工程菌修饰为失活或阻断n-乙酰甘露糖胺(mannac)的旁路分解途径；
19、(4)基因工程菌修饰为失活或阻断磷酸烯醇式丙酮酸的旁路分解途径；和
20、(5)基因工程菌修饰为增加参与寡糖转运途径的蛋白的表达或活性。
21、(6)基因工程菌修饰为降低或消除内源β-半乳糖苷酶的表达或活性。
22、(7)基因工程菌修饰为降低或消除n-乙酰神经氨酸的旁路分解途径。
23、在一个实施方案中，基因工程菌为埃希氏菌属的细菌，优选为大肠杆菌，更优选为大肠杆菌bl21(de3)菌株。
24、在一个实施方案中，基因工程菌以一种或多种如下的方式进行了修饰：
25、(8)基因工程菌修饰为降低或消除6-磷酸果糖激酶(pfka)的表达或活性；
26、(9)基因工程菌修饰为增加葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)的表达或活性；
27、(10)基因工程菌修饰为降低或消除n-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶(naga)和/或葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶(nagb)的表达或活性；
28、(11)基因工程菌修饰为增加胞苷单磷酸激酶(cmk)和多磷酸激酶(ppk)的表达或活性；
29、(12)基因工程菌修饰为降低或消除丙酮酸激酶(pyka)的表达或活性；
30、(13)基因工程菌修饰为增加寡糖转运蛋白的表达或活性；
31、(14)基因工程菌修饰为降低或消除n-乙酰神经氨酸醛缩酶(nana)的表达或活性；
32、(15)基因工程菌修饰为降低或消除n-乙酰甘露糖胺激酶(nank)的表达或活性；
33、(16)基因工程菌修饰为降低或消除n-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶(nane)的表达或活性；
34、(17)基因工程菌修饰为降低或消除β-半乳糖苷酶(lacz)的表达或活性。
35、在一个实施方案中，基因工程菌缺失了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因。
36、在一个实施方案中，基因工程菌过表达了葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因。
37、在一个实施方案中，基因工程菌缺失了葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶(nagb)基因。
38、在一个实施方案中，基因工程菌缺失了n-乙酰甘露糖胺激酶(nank)基因。
39、在一个实施方案中，基因工程菌缺失了n-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶(nane)基因。
40、在一个实施方案中，基因工程菌缺失了n-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶(naga)基因。
41、在一个实施方案中，基因工程菌过表达了胞苷单磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因。
42、在一个实施方案中，基因工程菌缺失了n-乙酰神经氨酸醛缩酶(nana)基因。
43、在一个实施方案中，基因工程菌缺失了丙酮酸激酶(pyka)基因。
44、在一个实施方案中，基因工程菌过表达了寡糖转运蛋白setb基因。
45、在一个实施方案中，基因工程菌缺失了β-半乳糖苷酶(lacz)基因。
46、在一个实施方案中，所述缺失了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因为：对6-磷酸果糖激酶(pfka)基因进行部分核苷酸序列的敲除，所述部分核苷酸序列的敲除包括：在5’端保留的核苷酸序列长度占6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的全部核苷酸序列长度的0％-7％，在3’端保留的核苷酸序列长度占6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的全部核苷酸序列长度的70％-80％。
47、在一个实施方案中，葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)包含：seq id no:89所示的氨基酸序列或与seq id no:89具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
48、在一个实施方案中，所述过表达了葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因为：将所述葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因整合到基因工程菌的基因组中。
49、在一个实施方案中，所述缺失了丙酮酸激酶(pyka)基因为：对丙酮酸激酶(pyka)基因进行部分核苷酸序列的敲除，所述部分核苷酸序列的敲除包括：在5’端保留的核苷酸序列长度占丙酮酸激酶(pyka)基因的全部核苷酸序列长度的4％-5.5％，在3’端保留的核苷酸序列长度占丙酮酸激酶(pyka)基因的全部核苷酸序列长度的10％-20％。
50、在一个实施方案中，胞苷单磷酸激酶(cmk)包含：seq id no:91所示的氨基酸序列或与seq id no:91具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；多磷酸激酶(ppk)包含：seq id no:90所示的氨基酸序列或与seq id no:90具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
51、在一个实施方案中，过表达了胞苷单磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因为：将所述胞苷单磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因整合到基因工程菌的基因组中。
52、在一个实施方案中，所述寡糖转运蛋白setb包含：seq id no:93所示的氨基酸序列或与seq id no:93具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
53、在一个实施方案中，过表达了寡糖转运蛋白setb基因包括：将所述寡糖转运蛋白setb基因整合到基因工程菌的基因组中。
54、在一个实施方案中，在敲除了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的部分核苷酸序列的条件下，所述葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因插入所述6-磷酸果糖激酶(pfka)基因被敲除的位置。
55、在一个实施方案中，基因工程菌缺失了蜜二糖通透酶(melb)基因，所述胞苷单磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因插入所述蜜二糖通透酶(melb)基因被敲除的位置。
56、在一个实施方案中，在敲除了丙酮酸激酶基因(pyka)基因的部分核苷酸序列的条件下，所述寡糖转运蛋白setb基因插入所述丙酮酸激酶基因(pyka)基因中被敲除的位置。
57、在一个实施方案中，胞苷单磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因以各自连接了单独的第二启动子的方式或者以共同连接了第二启动子的方式插入所述蜜二糖通透酶(melb)基因被敲除的位置。
58、在一个实施方案中，胞苷单磷酸激酶(cmk)基因位于多磷酸激酶(ppk)基因的上游。在一个实施方案中，所述第二启动子为t5启动子或四环素启动子tet。
59、在另一个方面，提供了一种大肠杆菌菌株，其保藏号为cgmcc no.:28244。
60、在另一个方面，提供了一种如本文所述的基因工程菌或如本文所述的大肠杆菌菌株在以葡萄糖或甘油为碳源生产3’-唾液酸乳糖中的应用。
61、在另一个方面，提供了构建具有产生3’-唾液酸乳糖的能力的基因工程菌的方法，其包括：将udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)彼此独立整合到或以任意组合共同整合到宿主菌体的基因组中，得到基因工程菌；或者，
62、将udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)共同导入骨架质粒中，得到重组质粒；将所述重组质粒导入到宿主菌体中，得到基因工程菌。
63、在一个实施方案中，构建具有产生3’-唾液酸乳糖的能力的基因工程菌的方法包括：将引入的外源udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、引入的外源唾液酸合酶基因(neub)、引入的外源n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和引入的外源α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)彼此独立整合到或以任意组合共同整合到宿主菌体的基因组中，得到基因工程菌；或者，
64、将引入的外源udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、引入的外源唾液酸合酶基因(neub)、引入的外源n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和引入的外源α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)共同导入骨架质粒中，得到重组质粒；将所述重组质粒导入到宿主菌体中，得到基因工程菌。
65、在一个实施方案中，所述宿主菌体为埃希氏菌属的细菌，优选为大肠杆菌，更优选为大肠杆菌bl21(de3)菌株。
66、在一个实施方案中，构建具有产生3’-唾液酸乳糖的能力的基因工程菌的方法还包括：将宿主菌体以一种或多种如下的方式进行修饰：
67、(1)宿主菌体修饰为增加葡萄糖胺-6-磷酸的生成量；
68、(2)宿主菌体修饰为使胞苷-5’-三磷酸持续循环再生；
69、(3)宿主菌体修饰为失活或阻断n-乙酰甘露糖胺(mannac)的旁路分解途径；
70、(4)宿主菌体修饰为失活或阻断磷酸烯醇式丙酮酸的旁路分解途径；
71、(5)宿主菌体修饰为增加参与寡糖转运途径的蛋白的表达或活性；
72、(6)宿主菌体修饰为降低或消除β-半乳糖苷酶的表达或活性；和
73、(7)宿主菌体修饰为降低或消除n-乙酰神经氨酸的旁路分解途径。
74、在一个实施方案中，基因工程菌以一种或多种如下的方式进行修饰：
75、(8)宿主菌体修饰为降低或消除6-磷酸果糖激酶(pfka)的表达或活性；
76、(9)宿主菌体修饰为增加葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)的表达或活性；
77、(10)宿主菌体修饰为降低或消除n-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶(naga)和/或葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶(nagb)的表达或活性；
78、(11)宿主菌体修饰为增加胞苷单磷酸激酶(cmk)和多磷酸激酶(ppk)的表达或活性；
79、(12)宿主菌体修饰为降低或消除丙酮酸激酶(pyka)的表达或活性；
80、(13)宿主菌体修饰为增加寡糖转运蛋白的表达或活性；
81、(14)宿主菌体修饰为降低或消除n-乙酰神经氨酸醛缩酶(nana)的表达或活性；
82、(15)宿主菌体修饰为降低或消除n-乙酰甘露糖胺激酶(nank)的表达或活性；
83、(16)宿主菌体修饰为降低或消除n-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶(nane)的表达或活性；和
84、(17)宿主菌体修饰为降低或消除β-半乳糖苷酶(lacz)的表达或活性。
85、在一个实施方案中，使宿主菌体缺失了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因。
86、在一个实施方案中，使宿主菌体过表达了葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因。
87、在一个实施方案中，使宿主菌体缺失了葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶(nagb)基因。
88、在一个实施方案中，使宿主菌体缺失了n-乙酰甘露糖胺激酶(nank)基因。
89、在一个实施方案中，使宿主菌体缺失了n-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶(nane)基因。
90、在一个实施方案中，使宿主菌体缺失了n-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶(naga)基因。
91、在一个实施方案中，使宿主菌体过表达了胞苷单磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因。
92、在一个实施方案中，使宿主菌体缺失了n-乙酰神经氨酸醛缩酶(nana)基因。
93、在一个实施方案中，使宿主菌体缺失了丙酮酸激酶(pyka)基因。
94、在一个实施方案中，使宿主菌体过表达了寡糖转运蛋白setb基因。
95、在一个实施方案中，使宿主菌体缺失了β-半乳糖苷酶(lacz)基因。
96、在一个实施方案中，所述使宿主菌体缺失了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因为：对6-磷酸果糖激酶(pfka)基因进行部分核苷酸序列的敲除，所述部分核苷酸序列的敲除包括：在5’端保留的核苷酸序列长度占6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的全部核苷酸序列长度的0％-7％，在3’端保留的核苷酸序列长度占6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的全部核苷酸序列长度的70％-80％。
97、在一个实施方案中，葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)包含：seq id no:89所示的氨基酸序列或与seq id no:89具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
98、在一个实施方案中，所述使宿主菌体过表达了葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因为：将所述葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因整合到宿主菌体的基因组中。
99、在一个实施方案中，所述使宿主菌体缺失了丙酮酸激酶(pyka)基因为：对丙酮酸激酶(pyka)基因进行部分核苷酸序列的敲除，所述部分核苷酸序列的敲除包括：在5’端保留的核苷酸序列长度占丙酮酸激酶(pyka)基因的全部核苷酸序列长度的4％-5.5％，在3’端保留的核苷酸序列长度占丙酮酸激酶(pyka)基因的全部核苷酸序列长度的10％-20％。
100、在一个实施方案中，胞苷单磷酸激酶(cmk)包含：seq id no:91所示的氨基酸序列或与seq id no:91具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；多磷酸激酶(ppk)包含：seq id no:90所示的氨基酸序列或与seq id no:90具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
101、在一个实施方案中，所述使宿主菌体过表达了胞苷单磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因为：将所述胞苷单磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因整合到宿主菌体的基因组中。
102、在一个实施方案中，所述寡糖转运蛋白setb包含：seq id no:93所示的氨基酸序列或与seq id no:93具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
103、在一个实施方案中，所述使宿主菌体过表达了寡糖转运蛋白setb基因包括：将所述寡糖转运蛋白setb基因整合到宿主菌体的基因组中。
104、在一个实施方案中，在敲除了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的部分核苷酸序列的条件下，还将所述葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因插入所述6-磷酸果糖激酶(pfka)基因被敲除的位置。
105、在一个实施方案中，缺失了宿主菌体的蜜二糖通透酶(melb)基因，所述胞苷单磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因插入所述蜜二糖通透酶(melb)基因被敲除的位置。
106、在一个实施方案中，在敲除了丙酮酸激酶基因(pyka)基因的部分核苷酸序列的条件下，将所述寡糖转运蛋白setb基因插入所述丙酮酸激酶基因(pyka)基因中被敲除的位置。
107、在一个实施方案中，所述胞苷单磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因以各自连接了单独的第二启动子的方式或者以共同连接了第二启动子的方式插入所述蜜二糖通透酶(melb)基因被敲除的位置。
108、在一个实施方案中，胞苷单磷酸激酶(cmk)基因位于多磷酸激酶(ppk)基因的上游。在一个实施方案中，所述第二启动子为t5启动子或四环素启动子tet。
109、在一个实施方案中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)以各自分别连接了单独的第一启动子和/或终止子的方式作为一个基因组合，或者以共同连接了第一启动子和/或终止子的方式作为一个基因组合插入宿主菌体基因组的一个或多个插入序列1(is1)位点处。
110、在一个实施方案中，引入的外源udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)作为一个基因组合插入在所述插入序列1(is1)处的拷贝数为10-28、12-26或14-22。
111、在一个实施方案中，使用包含同源臂1和同源臂2的ptargetf-nagab敲除naga和nagb基因,同源臂1使用seq id no:3和seq id no:4的引物以宿主菌体基因组为模板扩增得到，同源臂2使用seq id no:5和seq id no:6的引物以宿主菌体基因组为模板扩增得到。
112、在一个实施方案中，使用包含同源臂3和同源臂4的glms敲入donor-dna片段和ptargetf-pfka-nt1重组质粒敲除pfka基因并将glms基因敲入宿主菌体基因组中pfka基因被敲除的位置，同源臂3使用seq id no:11和seq id no:12的引物以宿主菌体基因组为模板扩增得到，同源臂4使用seq id no:19和seq id no:20的引物以宿主菌体基因组为模板扩增得到。
113、在一个实施方案中，使用包含同源臂5和同源臂6的ppk敲入donor-dna和ptargetf-melb-nt1重组质粒将ppk基因敲入宿主菌体基因组中，同源臂5使用seq id no:35和seq id no:36的引物以宿主菌体基因组为模板扩增得到，同源臂6使用seq id no:41和seq id no:42的引物以宿主菌体基因组为模板扩增得到。
114、在一个实施方案中，使用包含同源臂7和同源臂8的cmk敲入donor-dna和ptargetf-melb-nt2重组质粒将cmk基因敲入宿主菌体基因组中，同源臂7使用seq id no:43和seq id no:44的引物以宿主菌体基因组为模板扩增得到，同源臂8使用seq id no:49和seq id no:50的引物以宿主菌体基因组为模板扩增得到。
115、在一个实施方案中，使用包含同源臂9和同源臂10的setb敲入pyka位点donor-dna和ptargetf-pyka-nt2重组质粒敲除pyka基因并将setb基因敲入宿主菌体基因组中pyka基因被敲除的位置，同源臂9使用seq id no:58和seq id no:59的引物以宿主菌体基因组为模板扩增得到，同源臂10使用seq id no:64和seq id no:65的引物以宿主菌体基因组为模板扩增得到。宿主菌体优选大肠杆菌。
116、在另一个方面，提供了发酵生产3’-唾液酸乳糖的方法，该方法包括如下步骤：
117、在种子培养基中培养本文所述的基因工程菌或者本文所述的大肠杆菌菌株，得到种子；
118、将所述种子接种于发酵培养基中诱导培养，待发酵结束后获取含有3’-唾液酸乳糖的发酵液。
119、在一个实施方案中，所述发酵培养基中不含抗生素。
120、在一个实施方案中，所述种子培养基为lb培养基。
121、在一个实施方案中，所述发酵培养基包含tb培养基和碳源，所述碳源包括葡萄糖和/或甘油。
122、本发明的优点包括：
123、1.提供了一种高产3’-唾液酸乳糖的整合型工程菌，与现有技术的生产菌株(例如slis026菌株)相比具有更高的3’-唾液酸乳糖产量；
124、2.本文的基因工程菌为整合型菌株，不存在质粒丢失问题，遗传稳定性更高；
125、3.本发明的方法在敲除基因(例如pfka基因)时，在原基因的位置处整合靶基因(例如glms基因、setb基因)，从而实现靶基因在菌体细胞基因组中的过表达，减少基因操作的步骤，降低对菌体细胞生长和发酵的影响。
1.一种基因工程菌，其具有产生3’-唾液酸乳糖的能力，并且具有udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)；
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)以分别连接了单独的第一启动子和/或终止子的方式整合于所述基因工程菌的基因组中，或者存在于所述基因工程菌携带的重组质粒中；或者，
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)以各自分别连接了单独的第一启动子和/或终止子的方式作为一个基因组合，或者以共同连接了第一启动子和/或终止子的方式作为一个基因组合插入到基因工程菌的基因组的一个或多个插入序列1(is1)处；
4.根据权利要求1至3任意一项所述的基因工程菌，其中udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶包含：如seq id no:82所示的氨基酸序列，或与seq id no:82所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和/或，
5.根据权利要求1至4任意一项所述的基因工程菌，其中，基因工程菌以一种或多种如下的方式进行了修饰：
6.根据权利要求1-5任意一项所述的基因工程菌，其中，基因工程菌以一种或多种如下的方式进行了修饰：
7.根据权利要求1-6任意一项所述的基因工程菌，其中，基因工程菌缺失了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因；和/或
8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其中，所述缺失了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因为：对6-磷酸果糖激酶(pfka)基因进行部分核苷酸序列的敲除，所述部分核苷酸序列的敲除包括：在5’端保留的核苷酸序列长度占6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的全部核苷酸序列长度的0％-7％，在3’端保留的核苷酸序列长度占6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的全部核苷酸序列长度的70％-80％；和/或
9.根据权利要求8所述的基因工程菌，其中，在敲除了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的部分核苷酸序列的条件下，所述葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因插入所述6-磷酸果糖激酶(pfka)基因被敲除的位置；和/或
10.一种大肠杆菌菌株，其保藏号为cgmcc no.:28244。
11.一种如权利要求1至9任意一项所述的基因工程菌或如权利要求10所述的大肠杆菌菌株在以葡萄糖或甘油为碳源生产3’-唾液酸乳糖中的应用。
12.构建具有产生3’-唾液酸乳糖的能力的基因工程菌的方法，其包括：将udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)彼此独立整合到或以任意组合共同整合到宿主菌体的基因组中，得到基因工程菌；或者，
13.根据权利要求12所述的方法，其还包括：将宿主菌体以一种或多种如下的方式进行修饰：
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，将基因工程菌以一种或多种如下的方式进行修饰：
15.根据权利要求12-14任意一项所述的方法，其中，缺失了宿主菌体的6-磷酸果糖激酶(pfka)基因；和/或
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述缺失了宿主菌体的6-磷酸果糖激酶(pfka)基因为：对6-磷酸果糖激酶(pfka)基因进行部分核苷酸序列的敲除，所述部分核苷酸序列的敲除包括：在5’端保留的核苷酸序列长度占6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的全部核苷酸序列长度的0％-7％，在3’端保留的核苷酸序列长度占6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的全部核苷酸序列长度的70％-80％；和/或
17.根据权利要求16所述的方法，其中，在敲除了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的部分核苷酸序列的条件下，还将所述葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因插入所述6-磷酸果糖激酶(pfka)基因被敲除的位置；和/或
18.根据权利要求12至17任意一项所述的方法，其中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸转移酶基因(st)以各自分别连接了单独的第一启动子和/或终止子的方式作为一个基因组合，或者以共同连接了第一启动子和/或终止子的方式作为一个基因组合插入到宿主菌体的基因组的一个或多个插入序列1(is1)位点处；
19.根据权利要求12至18任意一项所述的方法，其中，使用包含同源臂1和同源臂2的ptargetf-nagab敲除naga和nagb基因,同源臂1使用seq id no:3和seq id no:4的引物以宿主菌体基因组为模板扩增得到，同源臂2使用seq id no:5和seq id no:6的引物以宿主菌体基因组为模板扩增得到；和/或
20.发酵生产3’-唾液酸乳糖的方法，该方法包括如下步骤：
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述发酵培养基中不含抗生素；和/或
