本发明总体上属于可用于检测样品中的目标分析物的基于有机电化学晶体管(oect)的免疫传感器器件和方法的领域。
背景技术：
1、可靠的生物分子诊断是用于早期检测疾病的重要工具，特别是用于预防传染病诸如hiv、埃博拉病毒和最近广泛传播的冠状病毒(sars-cov-2)的爆发，在撰写本文时该冠状病毒已在全球造成一百万人死亡。早期阶段检测对于在疾病传播之前识别并隔离无症状的被感染患者特别有用。因此，开发可以提供快速、方便的使用和准确的结果的检测方法至关重要。
2、检测方法诸如rrt-pct具有固有的局限性，诸如在实验室场合中进行劳动密集型样品制备，这会增加测试周转时间并且不适用于微小样品体积。此外，测试之前的样品运输和复杂样品制备步骤也可能降低临床灵敏度，导致假阴性结果。
3、有机电化学晶体管(oect)作为有前途的替代生物传感技术已引起关注，其可以超越其他最先进的电生物传感器方法诸如场效应晶体管(fet)。oect允许在水性环境中以低电压操作(<1v)和高放大率进行生物传感应用(lin和yan，2012)。oect通过监测器件接口中发生的电容或法拉第改变来检测靶分析物。迄今为止，实际的生物传感信号最普遍是提供自由特定分析物促进的酶促氧化还原反应。分析物与酶结合会诱导氧化还原反应，该氧化还原反应随后导致跨器件接口的电位下降，该电位下降随后放大为从晶体管源极端子流向漏极端子的电流的变化(bernard等人，2008；ohayon等人，2020)。oect生物传感器的重要优势是，其选择性可以通过合并合适的生物辨识元件来调谐，而无需荧光标记、放射性标记或其他标记(wustoni等人，2019；wustoni等人，2020)。
4、使用crispr-cas蛋白的酶促(主要是旁系裂解)活性的诊断工具是针对不同靶标可编程的，其中一些已与便携式检测方法诸如侧流条集成。然而，它们仍然需要耗时的样品预处理步骤，包括靶扩增和/或rna提取，以达到所需的阿托摩尔灵敏度。因此，从取得样品到得到最终结果的时间远远超过15min。虽然这些测试可以降低分子测试的成本和复杂性，但它们与例如确立的rt-lamp或更简化的rt-pcr解决方案相比似乎具有非常有限的优势。存在对在原始的未经处理样品中实现快速响应和高灵敏度的rna诊断工具的需求。
5、已开发出基于oect的免疫传感器，其中p型积累模式材料(p(g0t2-g6t2))被用作沟道材料，展现出单蛋白分子灵敏性和扩展的动态范围。vhh-72纳米抗体-oect生物传感器在环境条件下通过每3min手动移液30s孵育10min之后从未经处理的人体样品中检测特定蛋白质。此生物传感器涉及用于加速蛋白质向传感器的运输的繁琐移液步骤，导致相对较短的孵育时间，这对于基于扩散的运输是不可能的。因此，用于快速筛选和现场使用应用的高度自动化的粒子运输方法是至关重要的。
6、本发明的目的是提供基于oect的生物传感器，其实现减少的孵育时间和/或提高的灵敏度。
7、本发明的另一目的是提供用于制造用于诊断测定的基于oect的免疫传感器的方法。
8、本发明的另一目的是提供用于使用基于oect的生物传感器来检测样品中的分析物的改进方法。
技术实现思路
1、本文提供基于oect的生物传感器及其制造方法和使用方法。该生物传感器包括oect和生物辨识层。oect优选为电解质栅控晶体管，即包括源电极、漏电极、沟道和栅电极的三端子电子器件。在一些优选实施例中，生物辨识层集成在oect的栅电极上。
2、在一些形式中，生物辨识层包括生物分子的通过特定生物自催化偶联策略形成的一个生物自组装的单层(sam)(本文中的bio-sam)，如本文所公开，并且优选地排除使用一层使用有机分子形成的sam，即chem-sam，该层可以通过有机分子(诸如pct/ib2021/055981中公开的含硫醇的有机分子)的自组装来形成。bio-sam包括生物辨识元件、非作为完整抗体的蛋白质、不包括完整抗体的融合蛋白或crispr蛋白(例如，核糖核蛋白复合物cas:grna)。生物辨识元件包括针对目标分析物、优选地病原体或其组分的结合配偶体。在一个优选实施例中，生物辨识元件可以与sars-cov-2受体结合结构域(rbd)或刺突蛋白(s1)结合，该生物辨识元件优选是纳米抗体(例如，vhh72)或相关抗体片段，或crispr蛋白(诸如核糖核蛋白复合物cas:grna)。
3、oect表面上生物辨识元件的组构可以由以下通式表示：
4、l1-ap1:ap2-l2-b
5、式i
6、其中l1是第一接头，ap1是拥有特异性生物辨识序列的第一肽结合配偶体；ap2是辨识ap1上的此序列的第二肽结合配偶体；ap1和ap2是结合配偶体，优选地，共价结合配偶体；然而，他们可以是亲和对的成员；l2是第二接头，并且b是生物传感器的生物辨识元件。ap2-l2-b可以作为单个融合蛋白产生，而无需化学修饰。oect表面经由l1用l1-ap1来修饰。优选地，l1是包含其n或c末端处的半胱氨酸残基的肽序列，该半胱氨酸残基提供用于将l1与栅电极的表面直接偶联的游离sh基团。优选地，oect表面在oect与l1之间不以简单的有机烷硫醇或其衍生物诸如1,6-己二硫醇(hdt)修饰，即l1与oect直接偶联(本文称为直接功能化的oect)并提供针对ap2的特异性(生物衍生的)辨识序列ap1，而不是非特异性反应基团。换句话说，含有其上形成的生物辨识层的电极不含有游离有机分子，即在电极表面上自组装但不附接到l1-ap1并因此不附接到生物辨识元件的有机分子。例如，用生物辨识层修饰的栅电极不含有未连接到第一接头l1(诸如肽序列)的游离半胱氨酸。ap1和ap2的结合或偶联产生生物自组装的单层，本文为bio-sam。因此，生物辨识层包括接头l1和bio-sam。在一个特定实施例中，ap1是spytag并且ap2是spycatcher。
7、生物辨识层优选地集成在oect的栅电极上。
8、oect的沟道可以直接由传导聚合物形成，或者通过将传导聚合物合并在传导衬底的表面上(诸如通过将传导聚合物旋涂在金属电极的表面上)来形成。任何合适的传导聚合物均可以用于oect的沟道。在一些实施例中，用于oect的沟道的传导聚合物是p型聚合物。在一些实施例中，用于oect的沟道的传导聚合物是n型聚合物。在一些实施例中，用于oect的沟道的传导聚合物是掺杂聚(磺苯乙烯)的聚(3,4-乙撑二氧噻吩)(pedot:pss)或任何其他混合(离子和电子)半导体。在一些实施例中，用于oect的沟道的传导聚合物是p(g0t2-g6t2)。在一些实施例中，用于oect的沟道的传导聚合物是p(g3c2t2-t)。在一些实施例中，用于oect的沟道的传导聚合物是p(c6ndi-t)。取决于沟道材料，oect可以在耗尽模式或积累模式下操作。
9、还公开了用于制造含有针对任何目标分析物(例如来自任何病原体的抗原)的结合配偶体的oect器件的方法。该方法包括如下用包含针对目标分析物的结合配偶体的生物辨识层使oect的栅电极功能化：(i)使栅电极的表面的至少一部分与含有肽序列和第一肽结合配偶体的第一溶液接触，该肽序列优选包含其n或c末端处的半胱氨酸残基，并且(ii)使第一结合配偶体修饰的表面与含有接头或接头元件和针对分析物的结合配偶体的一种或多种溶液接触。用于使oect的栅电极功能化的方法排除以下步骤：在步骤(i)之前使栅电极的表面的至少一部分与含有含硫醇有机分子(诸如半胱氨酸)的溶液接触。
10、参考式i(l1-ap1:ap2-l2-b)，栅电极的表面的至少一部分与溶液接触，该溶液含有：肽序列(l1)，其优选包含最方便由在其n或c末端处的半胱氨酸残基提供的游离sh基团；和第一肽结合配偶体(ap1)，用于在电极的表面上形成第一结合配偶体层，并且使此第一结合配偶体层与含有ap2-l2-b的组合物在导致ap1和ap2缀合的条件下接触以形成生物自组装的层，并且在本文中称为bio-sam。在一个优选实施例中，ap1和ap2分别是spytag和spycatcher。spytag/spycatcher对之间的自催化共价结合使分析物结合配偶体在oect器件的表面上定向。在特别优选的实施例中，该方法包括使oect表面与含有spytag(spytag/spycatcher对中的一个配偶体)的第一溶液接触，之后与含有spycatcher(spytag/spycatcher对中的第二配偶体，该第二配偶体继而与针对目标分析物的结合配偶体连接)的第二溶液接触。在一个优选实施例中，目标分析物是sars-cov-2rbd并且其结合配偶体是特异性纳米抗体。
11、还公开了用于使用直接功能化的oect来识别目标分析物的方法。一个实施例包括使样品与本文所公开的直接功能化的基于oect的生物传感器(其包含针对目标分析物的结合配偶体)接触。另一实施例包括使用ac动电学/电流体动力学力，如本文所描述。
12、公开了使用ac动电学/电流体动力学力与基于oect的免疫传感器组合进行分析物检测的器件和方法。一般来说，基于oect的免疫传感器的栅电极被传导元件环绕，该传导元件用于在器件中施加ac动电学/电流体动力学力。
13、一个实施例提供如上文所描述的直接功能化的oect，而另一实施例提供间接纳米抗体功能化的oect(诸如pct/ib2021/055981中描述的那些)，任一实施例均与传导元件合并，该传导元件能够提供交流电热流(acet)的微搅拌效应来超快速检测复杂体液(诸如唾液、血浆、血清和血液)中的病原体诸如严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的单分子至纳摩尔水平。由施加到传导元件的经偏置ac电场诱导的acet流可以在一分钟内将分析物快速对流到同心栅电极上，并且经由辨识单元(纳米抗体)捕获来自病原体的抗原诸如sars-cov-2刺突蛋白(s1)或受体结合蛋白结构域(rbd)，同时将非特异性抗原从表面扫除。
1.一种生物传感器，所述生物传感器包括有机电化学晶体管(oect)和生物辨识层，其中所述oect包括源电极、漏电极、沟道和栅电极，其中所述源电极和所述漏电极经由所述沟道电连接，并且所述栅电极是可去除的并且位于与所述源电极、所述漏电极和所述沟道分离的位置。
2.一种生物传感器，所述生物传感器包括两个或更多个oect的阵列以及生物辨识层，其中所述阵列包括两个或更多个源电极、两个或更多个漏电极、两个或更多个对应沟道以及公共栅电极，其中每个源电极与一个漏电极配对并经由一个对应的沟道与所述漏电极电连接，并且所述公共栅电极是可去除的并且位于与所述源电极、所述漏电极和所述对应沟道分离的位置。
3.根据权利要求1或2所述的生物传感器，其中所述生物辨识层集成在所述oect的所述栅电极或所述公共栅电极上。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的生物传感器，其中所述生物辨识层相对于oect表面的取向能够由以下通式表示：
5.根据权利要求3或4所述的生物传感器，其中所述生物辨识元件是二结构域或单结构域抗体片段，诸如纳米抗体或cas蛋白。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的生物传感器，其中所述生物辨识元件辨识sar-cov-2受体结合结构域。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的生物传感器，其中所述l1直接附接到所述栅电极或公共栅电极的表面。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的生物传感器，其中所述l1包含seq id no:22或seq id no:23。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的生物传感器，其中所述ap1至ap2选自由以下项组成的组：spytag/spy catcher肽缀合物、snoopcatcher/snooptag、moontag/mooncatcher.snooptagjr/snoopcatcher或dogtag以及sdytag/sdycatcher肽缀合物。
10.根据权利要求9所述的生物传感器，其中所述ap1包含cggsgsgsgahivmvdaykptk(seq id no:24)或ahivmvdaykptkgsgc(seq id no:25)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的生物传感器，其中所述沟道或每个沟道包含选自由以下项组成的组的传导聚合物：pedot:pss、pedot-s、pedot:tos、pedotoh:clo4、pedot-co-pedotoh:clo4、p3ht、pths、bbl、p(g2t-tt)、pths-tma+-共-p3ht、p(gndi-g2t)、p(g0t2-g6t2)、p-90、p(g3c2t2-t)以及p(c6ndi-t)。
12.一种在电极上集成生物辨识层的方法，所述方法包括：
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一肽结合配偶体是spytag肽。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述第二缀合物是spycatcher-纳米抗体缀合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述纳米抗体是sar-cov-2受体结合结构域结合纳米抗体。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述封闭剂是bsa。
17.一种检测生物样品中的分析物的不存在、存在或浓度的方法，所述方法包括使所述生物样品与权利要求1或2所述的生物传感器接触，其中所述生物传感器进一步包括储存器，所述方法包括：
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法进一步包括通过以下测量所述背景id的步骤：
19.根据权利要求17和18所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：在步骤(i)至(vii)中的任一者之前将电解质溶液添加到所述储存器中。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中步骤(v)至(vii)重复一次或多次。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述生物样品是(a)选自由全血、血浆、血清、唾液、粘液、痰、支气管肺泡灌洗液(bal)、支气管冲洗液(bw)、脑脊液(csf)和尿液组成的组的体液，或者(b)非体液。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：在步骤(i)至(v)中的任一者之前将样本处理成所述生物样品，其中所述样本选自由组织、粪便、直肠拭子、鼻咽拭子和咽喉拭子组成的组，任选地，其中所述样品在孵育之前与缓冲液混合。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：在步骤(i)至(v)中的任一者之前将蛋白酶抑制剂添加到所述生物样品中，其中所述样品是唾液样品。
24.根据权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述生物样品的体积小于20μl、小于10μl或小于5μl。
25.根据权利要求17至24中任一项所述的方法，其中所述栅电极以所述生物样品孵育长达60分钟、长达50分钟、长达40分钟、长达30分钟、长达20分钟或长达10分钟的时间段。
26.一种交流电热流(acet)增强的生物传感器，其包括基于有机电化学晶体管(oect)的生物传感器和用于诱导acet的传导层，其中所述基于oect的生物传感器包括oect和生物辨识层，其中所述oect包括源电极、漏电极、沟道和栅电极，其中所述源电极和所述漏电极经由所述沟道电连接，并且所述栅电极是可去除的并且位于与所述源电极、所述漏电极和所述沟道分离的位置。
27.根据权利要求26所述的acet增强的生物传感器，其中所述基于oect的生物传感器包括两个或更多个oect的阵列，其中所述oect的阵列包括两个或更多个两个或更多个源电极、两个或更多个漏电极、两个或更多个沟道以及一个栅电极，其中每个源电极与一个漏电极配对并经由一个沟道与所述漏电极电连接，并且所述栅电极是可去除的并且位于与所述源电极、所述漏电极和所述沟道分离的位置。
28.根据权利要求26或27所述的acet增强的生物传感器，其中所述传导层被放置为非常接近所述oect的所述栅电极。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的acet增强的生物传感器，其中所述传导层沿着所述栅电极的边缘放置并且环绕所述栅电极的至少一部分。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的acet增强的生物传感器，其中所述栅电极的形状为圆形，其中所述传导层具有环绕圆形栅电极的至少一部分的拱形形状。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的acet增强的生物传感器，其中所述传导层包括被配置用于接触施加ac电位的电源的一个或多个延伸部分。
32.根据权利要求26至31中任一项所述的acet增强的生物传感器，其中所述生物辨识层集成在所述oect的所述栅电极上。
33.根据权利要求26至32中任一项所述的acet增强的生物传感器，其中所述生物辨识层相对于oect表面的取向能够由以下通式表示：
34.根据权利要求33所述的acet增强的生物传感器，其中所述l1包含n或c末端半胱氨酸残基。
35.根据权利要求33或34所述的acet增强的生物传感器，其中所述l1直接附接到所述栅电极的表面。
36.根据权利要求26至32中任一项所述的acet增强的生物传感器，其中所述生物辨识层相对于oect表面的取向能够由以下通式表示：
37.根据权利要求36所述的acet增强的生物传感器，其中n是烷硫醇或其衍生物。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的acet增强的生物传感器，其中所述生物辨识元件是二结构域或单结构域抗体片段，诸如纳米抗体或cas蛋白。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的acet增强的生物传感器，其中所述生物辨识元件辨识sar-cov-2受体结合结构域。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的acet增强的生物传感器，其中所述l1包含seqid no:22或seq id no:23。
41.根据权利要求33至40中任一项所述的acet增强的生物传感器，其中所述ap1至ap2选自由以下项组成的组：spytag/spy catcher肽缀合物、snoopcatcher/snooptag、moontag/mooncatcher.snooptagjr/snoopcatcher或dogtag以及sdytag/sdycatcher肽缀合物。
42.根据权利要求33至41中任一项所述的acet增强的生物传感器，其中所述ap1包含cggsgsgsgahivmvdaykptk(seq id no:24)或ahivmvdaykptkgsgc(seq id no:25)。
43.根据权利要求33至42中任一项所述的acet增强的生物传感器，其中所述沟道或每个沟道包含选自由以下项组成的组的传导聚合物：pedot:pss、pedot-s、pedot:tos、pedotoh:clo4、pedot-co-pedotoh:clo4、p3ht、pths、bbl、p(g2t-tt)、pths-tma+-共-p3ht、p(gndi-g2t)、p(g0t2-g6t2)、p-90、p(g3c2t2-t)以及p(c6ndi-t)。
44.一种检测生物样品中的分析物的不存在、存在或浓度的方法，所述方法包括使所述生物样品与根据权利要求26所述的acet增强的生物传感器接触，其中所述acet增强的生物传感器进一步包括储存器，所述方法包括：
45.根据权利要求17所述的方法，其中在步骤(v)之前和/或期间，ac电位被施加到所述生物传感器的传导层，其中所述ac电位足以引起微搅拌效应。
46.根据权利要求45所述的方法，所述ac电位在1vpp至8vpp或2vpp至6vpp的范围内，诸如约6vpp(pp是指峰到峰)。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过以下测量所述背景id的步骤：
48.根据权利要求44至47中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：在步骤(i)至(vii)中的任一者之前将电解质溶液添加到所述储存器中。
49.根据权利要求44至48中任一项所述的方法，其中步骤(v)至(vii)重复一次或多次。
50.根据权利要求44至49中任一项所述的方法，其中所述生物样品是(a)选自由全血、血浆、血清、唾液、粘液、痰、支气管肺泡灌洗液(bal)、支气管冲洗液(bw)、脑脊液(csf)和尿液组成的组的体液，或者(b)非体液。
51.根据权利要求44至50中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：在步骤(i)至(v)中的任一者之前将样本处理成所述生物样品，其中所述样本选自由组织、粪便、直肠拭子、鼻咽拭子和咽喉拭子组成的组，任选地，其中所述样品在孵育之前与缓冲液混合。
52.根据权利要求44至51中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：在步骤(i)至(v)中的任一者之前将蛋白酶抑制剂添加到所述生物样品中，其中所述样品是唾液样品。
53.根据权利要求44至52中任一项所述的方法，其中所述生物样品的体积小于20μl、小于10μl或小于5μl。
54.根据权利要求44至53中任一项所述的方法，其中所述栅电极以所述生物样品孵育长达5分钟、长达4分钟、长达3分钟、长达2分钟或长达1分钟的时间段。
55.根据权利要求44至54中任一项所述的方法，其中功耗为≤100nw。
