本发明涉及生物，特别涉及一种里氏木霉辅助人工混菌液体发酵产甲烷方法。
背景技术：
1、目前，木质纤维素生物质资源化利用方式主要包括肥料化、饲料化、能源化、基料化、原料化等。其中，玉米秸秆直接或间接还田、焚烧、作为动物饲料、厌氧发酵、制食用菌培养基料、作为工业生产原料等。在多种处理方式中，厌氧发酵能够产生沼肥和沼气，产生的沼气中甲烷含量为55%~70%，每立方米沼气的能量有20~25 mj（高忠坡等，我国农作物秸秆资源量及利用问题研究，农机化研究，2022年，第44卷第4期，第1-6页）。因此，将玉米秸秆等农业废弃物再利用并与清洁能源生产相结合，是一种具有广阔应用前景的资源化技术（石祖梁等，我国农作物秸秆综合利用现状及焚烧碳排放估算，中国农业资源与区划，2017年，第38卷第9期，第32-37页）。
2、目前，生物强化与生物刺激策略辅助微生物提升甲烷合成潜力已取得较好的研究成果。通过理性改造并完善混菌转化甲烷体系，并且对上述系统进行代谢活性提升可有效促进物质传输与终产物合成。针对上述问题，相关研究通过增大厌氧发酵过程固含量（2%~6%）以刺激微生物快速合成甲烷（wang s等，effects of rice straw biochar onmethanogenic bacteria and metabolic function in anaerobic digestion，sci rep，2022年，第12卷第1期，6971）。同时，调整活性污泥与底物的混合比例也可达到提升混菌快速转化底物的目的。目前，利用外源添加不同比例的活性碳、铁氧化合物等物质以强化混合菌群体系中电子传递过程及吸附小分子酸的能力，进而达到降低菌株的外源代谢压力的目的（lyu h等，recycling cinder in efficient methane production from wheat strawvia solid-state anaerobic digestion (ss-ad)，chemical engineering journal，2023年，462）。此外，通过添加不同类型微量重金属元素（fe2+、ni2+、co2+等）及表面活性剂以强化胞内能量代谢与菌体离散，其可强化甲烷生产能力（xu h等，enhancing directinterspecies electron transfer in syntrophic-methanogenic associations with(semi) conductive iron oxides: effects and mechanisms，sci total environ，2019年，第695卷，133876）。
3、当利用液体发酵制备甲烷时，保持微生物活力及完善碳代谢流对于木质纤维生物质生物利用与转化具有促进作用，因而优化液体发酵条件对于提升甲烷合成潜力至关重要。同时，木质纤维素生物质具有较强的“顽固性”，此屏障对于微生物利用与转化生物质中聚糖起到阻碍作用。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了一种里氏木霉辅助人工混菌液体发酵产甲烷方法，通过优化人工混菌-沼渣-碱处理玉米秸秆-猪尿液液体发酵试验体系，并且在上述最优体系中加入里氏木霉增加聚糖释放能力，提升液体发酵产甲烷潜力。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了甲烷的发酵体系，包括沼渣、经过碱预处理的秸秆、猪尿液，以所述发酵体系为300 ml计，还包括5 g活性炭，50 mg/l吐温-80为，15 mg/l锰离子。
4、在本发明的一些具体实施方案中，上述发酵体系还包括菌种组合；
5、所述菌种组合包括：
6、（a）、保藏编号为cgmcc no. 31759的克罗诺杆菌属（cronobacter. sp）菌株；和
7、（b）、保藏编号为cgmcc no. 31760的拟杆菌属（bacteroides. sp）菌株；和
8、（c）、保藏编号为cgmcc no. 31757的肠杆菌属（enterobacter. sp）菌株；和
9、（d）、保藏编号为cgmcc no. 31758的肠球菌属（enterococcus. sp）菌株。
10、在本发明的一些具体实施方案中，上述发酵体系的所述菌种组合还包括：
11、（e）、保藏号为cicc 13052的里氏木霉rut-c30（trichoderma reesei rut-c30）。
12、在本发明的一些具体实施方案中，上述发酵体系的所述经过碱预处理的秸秆的制备方法包括：按照秸秆10 g、浓度为11 g/l的氢氧化钠9 ml的比例混合，120℃反应30 min。
13、在本发明的一些具体实施方案中，上述发酵体系的以体积比计，所述沼渣的接种比例为2%，所述秸秆的接种比例为20%。
14、在本发明的一些具体实施方案中，上述发酵体系的所述秸秆为玉米秸秆。
15、本发明还提供了甲烷的生产方法，其基于上述发酵体系生产。
16、在本发明的一些具体实施方案中，上述生产方法包括：将所述沼渣、所述经过碱预处理的秸秆、所述猪尿液、所述活性炭、所述吐温-80、所述锰离子和所述发酵体系中的所述菌种组合混合，发酵，获得甲烷。
17、在本发明的一些具体实施方案中，上述生产方法中，od600为1.5的所述保藏编号为cgmcc no. 31759的克罗诺杆菌属（cronobacter. sp）菌株的接种量为1 ml；
18、od600为1.5的所述保藏编号为cgmcc no. 31760的拟杆菌属（bacteroides. sp）菌株的接种量为1 ml；
19、od600为1.5的所述保藏编号为cgmcc no. 31757的肠杆菌属（enterobacter. sp）菌株的接种量为1 ml；
20、od600为1.5的所述保藏编号为cgmcc no. 31758的肠球菌属（enterococcus. sp）菌株的接种量为1 ml。
21、在本发明的一些具体实施方案中，上述生产方法中，od600为2.0的所述保藏号为cicc 13052的里氏木霉rut-c30（trichoderma reesei rut-c30）的接种量为2 ml。
22、在本发明的一些具体实施方案中，上述生产方法的发酵时间为17 d。
23、本发明的方法有如下效果：
24、一方面，针对木质纤维素生物质自身结构复杂性造成的聚糖转化障碍进而导致甲烷发酵过程中产物合成效率低的问题，本发明首先对木质纤维素生物质液体发酵产甲烷体系进行优化，并且利用不同类型预处理对木质纤维素生物质进行解聚，提升了可再生资源液体发酵合成甲烷能力。
25、另一方面，本发明利用响应面方法获得了模型，试验结果显示该模型为极显著（p<0.01）且失拟项不显著（p>0.05），说明该模型的拟合程度较好、未知因素干扰小。该模型决定系数r2=0.9858、矫正决定系数r2adj=0.9675，说明响应值变化的96.75%能用该模型来解释，并且可有效分析和预测甲烷含量。本发明利用响应面方法优化人工混菌辅助沼渣-碱预处理玉米秸秆-猪尿液体系，结果显示，在活性炭为5 g、吐温-80为50 mg/l及锰离子含量为15 mg/l时，发酵体系气体积累量与甲烷合成含量分别提高至550 ml和5.37%。进一步地，利用保藏号为cicc 13052的原始菌株——里氏木霉rut-c30（trichoderma reesei rut-c30）及t-dna诱变技术构建的t. reesei trb1以辅助人工混菌-沼渣-碱预处理玉米秸秆-猪尿液体系进行液体发酵产甲烷试验，结果成功进一步提高气体积累量与甲烷合成效率，其中气体积累量和甲烷含量分别为900 ml和6.01%。
26、生物保藏说明
27、生物材料：hk-ept-7，分类命名：肠杆菌（enterobacter sp.），于2024年08月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号为cgmcc no. 31757。
28、生物材料：hk-ept-8，分类命名：肠球菌（enterococcus sp.），于2024年08月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号为cgmcc no. 31758。
29、生物材料：hk-ept-9，分类命名：克罗诺杆菌（cronobacter sp.），于2024年08月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号为cgmcc no. 31759。
30、生物材料：hk-ept-10，分类命名：拟杆菌（bacteroides sp.），于2024年08月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号为cgmcc no. 31760。
1.甲烷的发酵体系，包括沼渣、经过碱预处理的秸秆、猪尿液，其特征在于，以所述发酵体系为300 ml计，还包括5 g活性炭，50 mg/l吐温-80，15 mg/l锰离子。
2.如权利要求1所述的发酵体系，其特征在于，还包括菌种组合；
3.如权利要求2所述的发酵体系，其特征在于，所述菌种组合还包括：
4.如权利要求1至3任一项所述的发酵体系，其特征在于，所述经过碱预处理的秸秆的制备方法包括：按照秸秆10 g、浓度为11 g/l的氢氧化钠9 ml的比例混合，120℃反应30min。
5.如权利要求1至4任一项所述的发酵体系，其特征在于，以体积比计，所述沼渣的接种比例为2%，所述秸秆的接种比例为20%。
6.如权利要求1至5任一项所述的发酵体系，其特征在于，所述秸秆为玉米秸秆。
7.甲烷的生产方法，其特征在于，基于权利要求1至6任一项所述的发酵体系生产。
8.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于，包括：将所述沼渣、所述经过碱预处理的秸秆、所述猪尿液、所述活性炭、所述吐温-80、所述锰离子和权利要求2或3所述的发酵体系中的所述菌种组合混合，发酵，获得甲烷。
9.如权利要求8所述的生产方法，其特征在于，od600为1.5的所述保藏编号为cgmcc no.31759的克罗诺杆菌属（cronobacter. sp）菌株的接种量为1 ml；
10.如权利要求8或9所述的生产方法，其特征在于，od600为2.0的所述保藏号为cicc13052的里氏木霉rut-c30（trichoderma reesei rut-c30）的接种量为2 ml。
