本发明涉及细胞分离培养，具体而言，涉及一种牦牛输卵管上皮细胞的分离方法。
背景技术：
1、牦牛分布在以青藏高原为中心及其毗邻的高山、亚高山地区，是我国最珍贵的动物遗传资源之一，也是一个极为宝贵的基因库。如果说畜牧业是青藏高原的支柱产业，那么牦牛就是青藏高原的主导畜种，牦牛的繁育水平决定着青藏高原畜牧业的发展，其中，母牦牛作为繁殖系统的重要组成部分，在遗传育种中发挥着重要作用。
2、牦牛的输卵管是繁殖系统的重要器官，连接卵巢和子宫，作为早期胚胎发育的场所之一，输卵管上皮分泌细胞产生的输卵管液、纤毛细胞的摆动，以及管壁平滑肌的运动为受精、配子和早期胚胎运输、早期胚胎发育提供必要的支持，有着重要的生殖生理作用。因此，获得纯度高、活性好的输卵管上皮细胞可为深入解析牦牛输卵管生殖反应机制；克服体外早期胚胎的发育阻滞；提高胚胎发育的品质提供实验材料和研究依据，从而提高牦牛的妊娠率。
3、在2013年孙永刚等人通过运用机械刮取法和0.25％胰蛋白酶消化两种方法分离牦牛输卵管上皮细胞进行体外培养；2015年杨融将剪碎的输卵管组织块以胰蛋白酶i(含edta)加胶原酶i的消化法分离牦牛输卵管上皮细胞。时至今日，有关牦牛输卵管上皮细胞的分离培养方法还未更新。目前的牦牛输卵管上皮细胞体外分离方法中，机械刮取法只能获得大小不等的组织团块，分散的单细胞数较少，并且较大的细胞团块不容易贴壁且悬浮于培养液的表面，容易与其他细胞团块混杂在一起，不能获得纯度较高的上皮细胞；联合胰酶消化法虽然能获得较多的单细胞及体积较小的细胞团块，但是胰酶对上皮细胞伤害较大，使得上皮细胞在贴壁后增殖速度变慢，细胞悬液中细胞碎片变多，制备的培养液黏稠。而组织块先用胰蛋白酶i(含edta)消化，后加胶原酶i消化的方法对上皮细胞损伤大，另外组织块先用胰酶消化会有许多成纤维细胞，分离培养后还需经过差速消化法、差速贴壁法，来除去易被消化、易贴壁的成纤维细胞才能获得纯度高的输卵管上皮细胞。
4、鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种牦牛输卵管上皮细胞的分离方法以解决上述技术问题。
2、本发明是这样实现的：
3、第一方面，本发明提供了一种牦牛输卵管上皮细胞的分离方法，其包括如下步骤：
4、s1：取离体的牦牛两侧输卵管进行冲洗，然后纵向剖开输卵管，用刀刮取上层组织至容器中，加入重悬液进行重悬，离心，弃上清；
5、s2：消化：向弃去上清的容器中加入消化液，37℃±0.5℃震荡消化1-1.2h；消化液包括胶原酶ⅰ、accutase消化液和dnaseⅰ，每ml消化液中胶原酶ⅰ质量、accutase消化液酶量和dnaseⅰ酶量的混合比例为0.1-0.2mg：100-200u：5-10u；消化液与待消化组织的混合体积比例为2-2.5:1-1.5；
6、s3：终止消化后，对消化混合液进行过滤，收集细胞滤液进行离心，弃上清。
7、本发明具有以下有益效果：
8、本发明将胶原酶与accutase联合使用，使消化细胞过程变得更温和高效，避免了胰酶消化对于细胞表面抗原造成损害，致使分离后的细胞无法维持细胞抗原的完整性，影响细胞的分化等问题。在胶原酶与accutase联合水解细胞外基质的胶原蛋白时，添加dnaseⅰ能有效减少细胞分离过程中释放的dna，降低细胞粘稠度和凝集，提高细胞分离效率，促进了消化效率的提升，大大提高了细胞的活性与贴壁性。本发明提供的方法分离出的牦牛输卵管上皮细胞无需经过差速消化法、差速贴壁法等方法来除易被消化、易贴壁的成纤维细胞，制备方法更为简单，能够快速高效地获得纯度高的输卵管上皮细胞。
9、本发明提供的方法对哺乳动物细胞系更具有适用性，作为克服体外早期胚胎的发育阻滞，促进早期胚胎的发育和提高胚胎发育的品质的细胞模型，保持分离后的细胞抗原完整性对保护细胞未分化状态和多潜能性至关重要。
1.一种牦牛输卵管上皮细胞的分离方法，其特征在于，其包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的牦牛输卵管上皮细胞的分离方法，其特征在于，每mg待消化物与4-7ml的所述消化液混合。
3.根据权利要求1所述的牦牛输卵管上皮细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤s1中的重悬液为含100-200u/ml的青霉素和0.1-0.2mg/ml的链霉素的pbs溶液。
4.根据权利要求3所述的牦牛输卵管上皮细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤s1中的离心参数为：1500-1800r/min，离心3-5min。
5.根据权利要求1所述的牦牛输卵管上皮细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤s1中的冲洗是指：先用生理盐水冲洗离体的牦牛两侧输卵管，然后用酒精消毒，再用带抗生素的缓冲液去除酒精。
6.根据权利要求5所述的牦牛输卵管上皮细胞的分离方法，其特征在于，用生理盐水冲洗离体的牦牛两侧输卵管后，将输卵管浸泡在带抗生素的缓冲液中，然后进行酒精消毒和酒精的去除。
7.根据权利要求6所述的牦牛输卵管上皮细胞的分离方法，其特征在于，所述终止消化是用含10％胎牛血清的dmem/f12细胞培养液终止消化。
8.根据权利要求1所述的牦牛输卵管上皮细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤s3中的过滤是用40μm目径的细胞筛网进行过滤。
9.根据权利要求8所述的牦牛输卵管上皮细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤s3中的离心是在1500-1800r/min，离心3-5min。
10.根据权利要求9所述的牦牛输卵管上皮细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤s3离心弃上清后，用含10％fbs以及含100-200u/ml青霉素、0.1-0.2mg/ml链霉素和0.4-0.5μg/ml两性霉素b的dmem/f12细胞培养液重悬。
